测定犬血浆中Sodium Danshensu和Prunasin的浓度的方法技术

本发明专利技术公开了一种HPLC‑MS/MS法测定犬血浆中Sodium Danshensu和Prunasin的浓度的方法，PHLC‑MS/MS分析测定过程的工作条件包括PHLC和色谱条件，通过色谱柱、溶解液、流动相、保留时间等工艺条件的优化，使得整个测试过程更加可行，测量结果增加准确，减少了残留，提高了准确度以及回收率高，减小了基质效应以及干扰性。

A method for the determination of the concentrations of solid Danshensu and prunasin in dog plasma

【技术实现步骤摘要】
测定犬血浆中SodiumDanshensu和Prunasin的浓度的方法
本专利技术涉及了生物分析领域，尤其涉及一种HPLC-MS/MS法测定犬血浆中SodiumDanshensu和Prunasin的浓度的方法。
技术介绍
肝纤维化是肝病中的一种。人体患有肝纤维化后，容易出现疲乏无力、食欲减退等症状，可能还会出现慢性消化不良、出血等症状，这些症状会给人体造成很大伤害。扶正化瘀片是常用的治疗肝纤维化的中成药之一，其主要成分包括：五味子醇甲(Schisandrin)、五味子乙素(γ-Schisandrin)、马索亚内酯(MassoiaLactone)、丹参素钠(SodiumDanshensu)、野黑樱苷(Prunasin)、苦杏仁苷(Amygdalin)、柚皮素(Naringenin)、槲皮素(Quercetin)、芦丁(Rutin)、商陆苷(Ombuoside)及其代谢产物商陆素(Ombuin)、槲皮苷(Quercitrin)、山奈酚(Kaempferol)、葵烯酸钠(Sodium5-Hydroxy-2-Decenoic)。检测比格犬(Beagle犬)血浆中扶正化瘀片的毒代动力学特征，评估药物主要成分在比格犬体内的暴露水平，对于帮助了解药物在人体内的作用效果具有重要意义。因此，本领域技术人员持续致力于研究测定血浆中扶正化瘀片主要成分浓度的HPLC-MS/MS方法。
技术实现思路
为了克服现有技术中的缺陷，本专利技术实施例提供了一种HPLC-MS/MS法测定犬血浆中SodiumDanshensu和Prunasin的浓度的方法，PHLC-MS/MS分析测定过程的工作条件：(1)、PHLC条件：色谱柱：InertStainAQ-C18(2.1mmx50mm,5.0μm),SHIMADZU；柱温：35℃；流动相A：0.1％乙酸-水溶液；流动相B：甲醇-乙腈溶液(7/3，v/v)；进样体积：3.00μL；运行时间：4.80min；保留时间：SodiumDanshensu，大约1.68min；Prunasin，大约1.82min；Osalmide，大约2.04min；(3)、质谱条件：质谱仪：ABSCIEXAPI5000LC/MS/MSsystem；离子源：ESI电喷雾电离；离子化模式：Negative；涡旋离子喷雾温度：550℃。进一步地，包括如下步骤：(1)对SodiumDanshensu、Prunasin和Osalmide各取1.00mg/mL，并且分别溶于甲醇中，配置得到SodiumDanshensu储备液、Prunasin储备液和Osalmide储备液，≤-15℃密闭，遮光保存，其中Osalmide作为内标；将所述SodiumDanshensu储备液和所述Prunasin储备液分别用甲醇溶液稀释成浓度为2*105、1.6*105ng/mL的校正标示样品工作液；将所述SodiumDanshensu和所述Prunasin等浓度混合，再用甲醇溶液稀释成浓度为4*104、1.6*104、1600、400、200ng/mL的校正标示样品工作液；将所述SodiumDanshensu储备液和所述Prunasin储备液分别用甲醇溶液稀释成浓度为1.5*105、1.0*105ng/mL的质控工作液；将所述SodiumDanshensu和所述Prunasin混合再用甲醇溶液稀释成浓度为6*104、600、200ng/mL的质控工作液；将所述Osalmide储备液用甲醇溶液稀释成浓度为1*104、50ng/mL的内标工作液；将所述校正标示样品工作液用空白基质稀释成浓度为1*104、8000、2000、800、80、20、10ng/mL的所述校正标示样，所述空白基质为不含分析物与内标的犬血浆，在本实施例中指不含SodiumDanshensu、Prunasin和Osalmide；将所述质控工作液用所述空白基质稀释成浓度为7500、5000、300、30、10ng/mL的所述质控样品；(2)样品处理：取等体积的所述校正标示样和所述质控样品，分别加入270μL的50ng/mL所述内标工作液，封板后涡旋混匀离心，离心后取上清液150μL至所述96孔板中，并加入100μL的甲醇溶液。然后再密封孔板，进行低速涡旋混匀，取3.0μL在高效液相质谱联用仪(HPLC-MS/MS)上进样分析；(3)标准曲线的制作：以Y＝aX+b制作标准曲线，X为分析物浓度，Y为色谱峰面积比；(4)定量分析：根据步骤(2)对待测样品进行处理，并按照步骤(3)所得所述标准曲线计算得到所述待测样品中的SodiumDanshensu、Prunasin的浓度。进一步地，所述步骤(2)中的离心条件为：10℃，4000rpm，离心10min。进一步地，所述步骤(2)中还包括对空白(BK)样品的处理：吸取30μL的空白基质，加入270μL的甲醇溶液，封板后涡旋混匀，在10℃，4000rpm条件下离心10min，离心后取上清液150μL至所述96孔板中，并加入100μL的甲醇溶液，然后再密封孔板，进行低速涡旋混匀，取3.0μL进行分析。进一步地，所述步骤(2)中还包括对QC0样品的处理：吸取30μL空白基质，再加入270μL所述内标工作液，封板后涡旋混匀，在10℃，4000rpm条件下离心10min，离心后取上清液150μL至所述96孔板中，并加入100μL的甲醇溶液，然后再密封孔板，进行低速涡旋混匀，取3.0μL进行分析。进一步地，所述步骤(2)中还包括对ULOQwithoutIS样品的处理：最高定量限不含内标的空白基质，加入270μL的甲醇溶液，封板后涡旋混匀，在10℃，4000rpm条件下离心10min，离心后取上清液150μL至所述96孔板中，并加入100μL的甲醇溶液。然后再密封孔板，进行低速涡旋混匀，取3.0μL进行分析。进一步地，所述步骤(2)中还包括对基质效应样品的处理：取单个供体(n≥6)的30μL的空白基质，并加入270μL甲醇溶液，涡旋离心后取上清液150μL，并加入100μLNeat溶液，然后再密封孔板，进行低速涡旋混匀，取3.0μL进行分析。进一步地，所述步骤(2)中还包括对回收率样品的处理：取单个供体的空白基质，再取30μL的多个供体的混合的所述空白基质形成所述回收率样品，并加入270μL甲醇溶液，涡旋离心后取上清液150μL，并加入100μLNeat溶液，然后再密封孔板，进行低速涡旋混匀，取3.0μL进行分析。本专利技术的有益效果如下：通过色谱柱、溶解液、流动相、保留时间等工艺条件的优化，使得整个测试过程更加可行，测量结果增加准确，减少了残留，提高了准确度以及回收率高，减小了基质效应以及干扰性。为让本专利技术的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附图式，作详细说明如下。附图说明为了更清楚地本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种HPLC-MS/MS法测定犬血浆中Sodium Danshensu和Prunasin的浓度的方法，其特征在于，/nPHLC-MS/MS分析测定过程的工作条件/n(1)、PHLC条件：/n色谱柱：InertStain AQ-C18(2.1mm x 50mm,5.0μm),SHIMADZU；/n柱温：35℃；/n流动相A：0.1％乙酸-水溶液；/n流动相B：甲醇-乙腈溶液(7/3，v/v)；/n进样体积：3.00μL；/n运行时间：4.80min；/n保留时间：Sodium Danshensu，大约1.68min；Prunasin，大约1.82min；Osalmide，大约2.04min；/n(2)、质谱条件：/n质谱仪：AB SCIEX API5000LC/MS/MS system；/n离子源：ESI电喷雾电离；/n离子化模式：Negative；/n涡旋离子喷雾温度：550℃。/n

【技术特征摘要】
1.一种HPLC-MS/MS法测定犬血浆中SodiumDanshensu和Prunasin的浓度的方法，其特征在于，
PHLC-MS/MS分析测定过程的工作条件
(1)、PHLC条件：
色谱柱：InertStainAQ-C18(2.1mmx50mm,5.0μm),SHIMADZU；
柱温：35℃；
流动相A：0.1％乙酸-水溶液；
流动相B：甲醇-乙腈溶液(7/3，v/v)；
进样体积：3.00μL；
运行时间：4.80min；
保留时间：SodiumDanshensu，大约1.68min；Prunasin，大约1.82min；Osalmide，大约2.04min；
(2)、质谱条件：
质谱仪：ABSCIEXAPI5000LC/MS/MSsystem；
离子源：ESI电喷雾电离；
离子化模式：Negative；
涡旋离子喷雾温度：550℃。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)对SodiumDanshensu、Prunasin和Osalmide各取1.00mg/mL，并且分别溶于甲醇中，配置得到SodiumDanshensu储备液、Prunasin储备液和Osalmide储备液，≤-15℃密闭，遮光保存，其中Osalmide作为内标；
将所述SodiumDanshensu储备液和所述Prunasin储备液分别用甲醇溶液稀释成浓度为2*105、1.6*105ng/mL的校正标示样品工作液；将所述SodiumDanshensu和所述Prunasin等浓度混合，再用甲醇溶液稀释成浓度为4*104、1.6*104、1600、400、200ng/mL的校正标示样品工作液；
将所述SodiumDanshensu储备液和所述Prunasin储备液分别用甲醇溶液稀释成浓度为1.5*105、1.0*105ng/mL的质控工作液；将所述SodiumDanshensu和所述Prunasin混合再用甲醇溶液稀释成浓度为6*104、600、200ng/mL的质控工作液；
将所述Osalmide储备液用甲醇溶液稀释成浓度为1*104、50ng/mL的内标工作液；
将所述校正标示样品工作液用空白基质稀释成浓度为1*104、8000、2000、800、80、20、10ng/mL的所述校正标示样，所述空白基质为不含分析物与内标的犬血浆，在本实施例中指不含SodiumDanshensu、Prunasin和Osalmide；
将所述质控工作液用所述空白基质稀释成浓度为7500、5000、300、30、10ng/mL的所述质控样品；
(2)样品处理：取等体积的所述校正标示样和所...

【专利技术属性】
技术研发人员：王樱桃，魏征，
申请(专利权)人：安领生物医药苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32