一种含黑松露菌成分物质的荧光PCR鉴定检测方法技术

本发明专利技术涉及一种含黑松露菌成分物质的荧光PCR鉴定检测方法，该荧光PCR鉴定检测方法的引物信息包括：上游引物(F)；下游引物(R)；探针(P)。本发明专利技术所述的含黑松露菌成分物质包括：黑松露菌子实体或速冻/冻干黑松露子实体或黑松露菌干片/块或黑松露菌粉末的任何一种或几种组合。本发明专利技术填补了目前黑松露菌分子鉴定的技术空白，尤其是对含有黑松露菌粉碎混合物分子鉴定的技术空白；具有检测快速、特异性高、结果清晰等显著优点。

A fluorescent PCR method for identification and detection of substances containing truffles

【技术实现步骤摘要】
一种含黑松露菌成分物质的荧光PCR鉴定检测方法
本专利技术属于生物质检测方法
，尤其是属于适用于含黑松露菌成分物质的荧光PCR鉴定检测方法

技术介绍
黑松露菌：也叫黑块菌，英文名Truffle，拉丁名为(TuberindicumCooke&Massee)。黑松露菌生长在橡木或榉树的根部，与松无关。在欧美，黑松露菌与鹅肝酱和鱼子酱同称为三大珍品，欧洲人誉为“餐桌上的钻石”。在中国云南省，由于当地得天独厚的气候和土壤等条件，野生菌资源异常丰富，乃全国之首。在国际市场上，订购需求巨大的菌类为：白牛肝菌、松茸、块菌、羊肚菌、鸡油菌。云南地区的野生菌产品主要销售的国外市场是日本和欧盟。正是因为云南的黑松露菌在整体野生菌产业链中所占的比重非常大，是对外贸易的主打特色产品，且价值极高。海关部门在执行把守国门安全、执行打击走私任务时，需要核实商品成分是否与标称或声称的成分一致。因此有对完整的黑松露菌子实体(菌体)和黑松露菌制品进行成分鉴定的需求。然而，国内外尚没有对黑松露菌及其制品的成分鉴定检测方法，为支撑快速检测鉴定黑松露菌物种品种的需求，本研究提供一种含黑松露菌(TuberindicumCooke&Massee)成分物质的荧光PCR鉴定检测方法。
技术实现思路
本专利技术正是为了克服上述现有技术缺陷，提供一种含黑松露菌(TuberindicumCooke&Massee)成分物质的荧光PCR鉴定检测方法。本专利技术填补了目前黑松露菌分子鉴定的技术空白，尤其是对含有黑松露菌粉碎混合物分子鉴定的技术空白；具有检测快速、特异性高、结果清晰等显著优点。本专利技术采用如下技术方案实现。一种含黑松露菌成分物质的荧光PCR鉴定检测方法，该荧光PCR鉴定检测方法的引物信息不包括：上游引物(F)5’-TCCTGAACATAAACCTCC-3’；下游引物(R)5’-AGACGGCATAATCAAATAC-3’；探针5’-(P)(FAM)CACTCCATGTTGCTTCCACGG(Eclipse)-3’。进一步为，本专利技术该荧光PCR鉴定检测方法的引物信息包括：上游引物(F)5’-GTCAGATTTACTGAAGTAAA-3’；下游引物(R)5’-CGATGATTCACTGAATTC-3’；探针(P)(FAM)TTCAACAACGGATCTCTTGGCTC(Eclipse)。进一步为，本专利技术该荧光PCR鉴定检测方法的引物信息仅为：上游引物(F)5’-GTCAGATTTACTGAAGTAAA-3’；下游引物(R)5’-CGATGATTCACTGAATTC-3’；探针(P)(FAM)TTCAACAACGGATCTCTTGGCTC(Eclipse)。进一步为，本专利技术该荧光PCR鉴定检测方法的反应体系为：进一步为，本专利技术该荧光PCR鉴定检测方法的实时荧光PCR的引物退火温度不得低于58℃。进一步为，本专利技术该荧光PCR鉴定检测方法的实时荧光PCR的引物退火温度为58℃-62℃。进一步为，本专利技术该荧光PCR鉴定检测方法的实时荧光PCR的引物退火温度为60℃。进一步为，本专利技术该荧光PCR鉴定检测方法的实时荧光PCR反应参数为：扩增条件为：50℃2min；95℃10min；95℃15s，60℃40s，40个循环。本专利技术所述的含黑松露菌成分物质包括：黑松露菌子实体或速冻/冻干黑松露子实体或黑松露菌干片/块或黑松露菌粉末的任何一种或几种组合。一种检测含黑松露菌成分物质的试剂盒，本专利技术该试剂盒的使用包括以上技术方案各段所述的方法。本专利技术的有益效果为：1、本专利技术引物信息特异性高，使用本专利技术的技术方案仅对黑松露菌进行分子鉴定，对其他菌种均表现为阴性；2、本专利技术的技术方案不单对黑松露菌菌体实现鉴定分子鉴定，同样对含有黑松露菌成分的其他物质也可以进行有效鉴定，这样就可以对已粉碎的混合菌产品进行有效鉴定，极大地打击不法商贩将在其他菌体冒充黑松露菌或者谎报商品为黑松露菌的可能性；3、本专利技术引物退火温度打破常识常规，提高至60℃左右，配以淘汰率极高后筛选的引物和反应体系，最终达到完美组合；4、本专利技术技术方案对DNA质量要求不高，所需DNA能够达到分子鉴定最低的浓度和量即可完成整套操作步骤，对通关商品的破坏几乎没有；5、本专利技术检测时间可控制在2小时以内，可以满足海关监管技术要求。下面采用附图和具体实施方式对本专利技术做进一步解释。附图说明图1为使用本专利技术技术方案对6种含黑松露菌成分的物质及其他6种其他菌种的荧光定量PCR的检测图；图注：阳性信号为1黑松露菌(TuberindicumCooke&Massee)、2速冻黑松露菌(TuberindicumCooke&Massee)3黑松露菌干片(TuberindicumCooke&Massee)、4FD冻干黑松露菌(TuberindicumCooke&Massee)、5黑松露菌粉(TuberindicumCooke&Massee)、6黑松露菌干(TuberindicumCooke&Massee)；阴性信号为7黑牛肝(Neoboletusobscureumbrinus(Hongo)N.K.Zeng,H.Chai&ZhiQ.Liang)、8凹陷块菌(TuberexcavatumVittad.)、9云南硬皮马勃(SclerodermayunnanenseY.Wang)、10网盖牛肝菌(Boletusreticuloceps(M.Zangetal.)Q.B.Wang&Y.J.Yao)、11皱盖牛肝菌(Rugiboletusextremiorientalis(Lj.N.Vassiljeva)G.Wu&ZhuL.Yang)、12香菇(Lentinusedodes)、13空白对照。图2为本专利技术研究过程中失败的案例之一的荧光定量PCR的检测图；阴性信号的样品为：黑松露菌(TuberindicumCooke&Massee)、速冻黑松露菌(TuberindicumCooke&Massee)、黑松露菌干片(TuberindicumCooke&Massee)、FD冻干黑松露菌(TuberindicumCooke&Massee)、黑松露菌粉(TuberindicumCooke&Massee)、黑松露菌干(TuberindicumCooke&Massee)；黑牛肝(Neoboletusobscureumbrinus(Hongo)N.K.Zeng,H.Chai&ZhiQ.Liang)、凹陷块菌(TuberexcavatumVittad.)、云南硬皮马勃(SclerodermayunnanenseY.Wang)、网盖牛肝菌(Boletusreticuloceps(M.Zangetal.)Q.B.Wang&Y.J.Yao)、皱盖牛肝菌(Rugiboletuse本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种含黑松露菌成分物质的荧光PCR鉴定检测方法，其特征在于，该荧光PCR鉴定检测方法的引物信息不包括：上游引物(F)5’-TCCTGAACATAAACCTCC-3’；下游引物(R)5’-AGACGGCATAATCAAATAC-3’；探针5’-(P)(FAM)CACTCCATGTTGCTTCCACGG(Eclipse)-3’。/n

【技术特征摘要】
1.一种含黑松露菌成分物质的荧光PCR鉴定检测方法，其特征在于，该荧光PCR鉴定检测方法的引物信息不包括：上游引物(F)5’-TCCTGAACATAAACCTCC-3’；下游引物(R)5’-AGACGGCATAATCAAATAC-3’；探针5’-(P)(FAM)CACTCCATGTTGCTTCCACGG(Eclipse)-3’。


2.根据权利要求1所述的一种含黑松露菌成分物质的荧光PCR鉴定检测方法，其特征在于，该荧光PCR鉴定检测方法的引物信息包括：上游引物(F)5’-GTCAGATTTACTGAAGTAAA-3’；下游引物(R)5’-CGATGATTCACTGAATTC-3’；探针(P)(FAM)TTCAACAACGGATCTCTTGGCTC(Eclipse)。


3.根据权利要求2所述的一种含黑松露菌成分物质的荧光PCR鉴定检测方法，其特征在于，该荧光PCR鉴定检测方法的引物信息仅为：上游引物(F)5’-GTCAGATTTACTGAAGTAAA-3’；下游引物(R)5’-CGATGATTCACTGAATTC-3’；探针(P)(FAM)TTCAACAACGGATCTCTTGGCTC(Eclipse)。


4.根据权利要求3所述的一种含黑松露菌成分物质的荧光PCR鉴定检测方法，其特征在于，该荧光PCR鉴定检测方法的...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈丽萍，朱红玉，丁元明，张薇，张银，高山，王英，杨玲春，李云飞，殷红，陈宏仙，陈芸，李芳，范效英，吕廷保，刘燕，
申请(专利权)人：昆明海关技术中心，
类型：发明
国别省市：云南;53