本发明专利技术涉及蓝萼甲素（GLA）小分子探针及其制备方法和应用，属药物化学领域。所述蓝萼甲素小分子探针结构上包括蓝萼甲素（GLA）、连接基团（Linker）和报告基团（生物素，biotin）三部分组成，具有通式I、通式I’两种异构体结构。本发明专利技术设计的蓝萼甲素分子探针经过体外抗肿瘤活性测试，结果显示：其对肿瘤细胞有较好的抑制作用，可作为小分子探针用于蓝萼甲素的作用机制研究。
Blue calyx a small molecule probe and its preparation and Application
【技术实现步骤摘要】
蓝萼甲素小分子探针及其制备方法和应用
本专利技术涉及蓝萼甲素小分子探针及其制备方法与抗肿瘤作用，属药物化学领域。
技术介绍
活性天然产物的发现和结构修饰在创新药物研发中起着重要的作用。据统计，1980年至今，全球批准上市的创新药物中，约50％左右是天然药物的直接应用或活性天然产物的结构修饰物。但这些药物中，大多是通过基于细胞效应的筛选而发现，其作用靶点和作用机制往往在临床应用多年后仍然未知，其中一些药物的毒副作用导致了药物研发在临床试验阶段中止甚至进入市场后被召回，造成了巨大的经济损失甚至威胁生命安全。因此，活性小分子化合物在细胞内作用靶点的确定是药物化学、化学生物学、特别是药物研发过程中的关键问题之一。蓝萼甲素(GlaucocalyxinA，GLA)是从唇形科香茶菜属药用植物蓝萼香茶菜中分离得到对映-贝壳杉烷型四环二萜化合物，1981年许云龙等人首次从植物蓝萼香茶菜中分离得到，并用波谱方法鉴定了其结构，其在蓝萼香茶菜的干燥叶子中含量高达1.03％(张元桐,沙东旭,沙明,等.中国中药杂志,1991,16(11):679.)。研究表明蓝萼甲素的活性中心基团为α,β-不饱和酮单元，体外抗肿瘤实验表明，蓝萼甲素有良好的抑制前列腺癌DU-145、直肠癌Lovo、人早幼粒白血病细胞HL-60等肿瘤细胞株增殖的作用。特别对直肠癌(Lovo)、非激素依赖性前列腺癌(DU-145)细胞最为敏感。形态学观察发现，浓度为50、25μmol/L的蓝萼甲素可诱导DU-145、Lovo肿瘤细胞发生细胞凋亡。中国专利201210015481.4“一种蓝萼甲素衍生物及其制备方法和应用”报道了蓝萼甲素缩醛衍生物对肝癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌、食管癌、绒癌、前列腺癌、直肠癌、急性粒细胞白血病或慢性粒细胞白血病有显著的增值抑制作用，是一种很有前景的抗肿瘤活性先导化合物。论文报道了(LiuCX,YinQQ,ZhouHC,etal.Naturechemicalbiology,2012,8:486-493.)类似于蓝萼甲素的四环二萜类化合物Adenanthin，通过分子探针技术鉴定了Adenanthin对白血病细胞(leukemiccells)的作用靶标是过氧化物还原酶peroxiredoxinI和II。综上，尽管蓝萼甲素在体外具有良好的抗肿瘤作用，但其构效关系研究较少，活性化合物的设计与合成是研究中心的难点，作用靶点和作用机制也不明确。因此需要设计并制备出具有生物活性的小分子探针，对蓝萼甲素药物作用靶点和抗肿瘤机制研究具有重要意义。生物素作为一种常用的标记基团，目前未见有生物素与蓝萼甲素连接形成“生物素-蓝萼甲素”生物素标记的探针，从而调取其作用靶点的实验报道。
技术实现思路
为了克服现有蓝萼甲素作用靶点和抗肿瘤机制研究的不足，本专利技术的目的是设计合成蓝萼甲素小分子探针，通过引入两亲性的聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)和二羧酸组成的连接基团将蓝萼甲素和生物素报告基团连接起来组成新型的小分子探针。本专利技术保留蓝萼甲素的α，β-不饱和酮的活性中心和羟基等活性基团，引入毒性小易代谢的聚乙二醇和二酸基团，得到水溶性好，有良好的抗肿瘤活性分子探针，为进一步研究蓝萼甲素的作用机制提供模板分子。本专利技术的技术方案如下所示：1.蓝萼甲素小分子探针，其具有通式I、I’的结构：n为1、2或3；m为2或3。2.所述蓝萼甲素小分子探针优选为1～6所示化合物及其异构体:3.本专利技术提供蓝萼甲素分子探针的合成方法，如下反应过程所示：1)biotin-PEG-NH2的制备：(1)聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)与对甲苯磺酰氯或甲磺酰氯溶于有机溶剂，冰浴，碱性条件发生取代反应，反应结束后有机溶剂萃取，干燥、过滤、浓缩得到两端磺酰基取代中间体。酰氯优选对甲苯磺酰氯，与聚乙二醇的摩尔比为1:2～1:4,优选1:2.2。所述碱选用氢氧化钾、氢氧化钠、碳酸钾、碳酸钠、吡啶、三乙胺、DMAP、二异丙基乙胺、N-甲基吗啉中的一种或几种；(2)对甲苯磺酸酯衍生物与叠氮钠溶于有机溶剂，加热发生取代反应，反应结束后用有机溶剂萃取，干燥、过滤、浓缩得到两端叠氮衍生物；步骤(1)、(2)所述有机溶剂选N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二甲基亚砜、二氯甲烷、甲醇、乙腈、乙酸乙酯、石油醚、二氧六环、乙醇中的一种或几种。(3)两端叠氮衍生物与还原剂溶于有机溶剂，酸性条件，惰性气体气氛下发生还原反应。反应结束后，用有机溶剂萃取，干燥、过滤、浓缩得到氨基叠氮衍生物；所述惰性气体选自氮气或氩气；所述还原剂选自三苯基磷、氢气/钯碳、硼氢化钠、四丁基硼氢化铵、氢化铝锂、二甲氨基硼烷中的一种或者几种。(4)氨基叠氮衍生物与生物素biotin溶于有机溶剂，室温反应过夜，旋干溶剂，柱层析得到生物素叠氮衍生物biotin-PEG-N3；所述有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二甲基亚砜、二氯甲烷、甲醇、乙腈、乙酸乙酯、石油醚、二氧六环、乙醚、乙醇中的一种或两种；(5)biotin-PEG-N3在还原条件下还原叠氮为氨基，反应结束后旋干溶剂得到biotin-PEG-NH2。所述还原剂选自三苯基磷、氢气/钯碳、硼氢化钠、四丁基硼氢化铵、氢化铝锂、二甲氨基硼烷中的一种或者几种。2)通式I和I’化合物的制备包括如下步骤：(1)：蓝萼甲素与酸酐溶于有机溶剂中，碱性条件下加热回流发生酯化反应得到7α，14β末端羧基的衍生物。(2)：将得到的蓝萼甲素末端羧基的衍生物、HOBT(1-羟基苯并三唑)溶于有机溶剂中，加入报告基团biotin-PEG-NH2、催化剂，在碱性条件下发生酰胺反应，合成含有酰胺基团的分子探针通式I或I’。由于蓝萼甲素7α，14β羧基衍生物常温下可在7α位和14β位互变异构，得到的含有酰胺基团的分子探针是蓝萼甲素7α位和14β位两个异构体分子探针。所述催化剂选EDCI(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)；步骤(1)中，所述有机溶剂为THF、CH2Cl2、DMF、DMSO中的一种；酸酐优选为丁二酸酐或戊二酸酐，蓝萼甲素与酸酐的摩尔比为1:2。反应加热回流时间优选为3～4h。步骤(2)中，所述生物素报告基团(RG-PEG-NH2)与蓝萼甲素7α，14β末端羧基的衍生物与EDCI与HOBT的优选摩尔比为1:1:1.5:1.2；所述有机溶剂为DMF、THF、CH2Cl2中的一种或几种；反应时间为室温反应6～12h。步骤(1)、(2)中，碱选自三乙胺、吡啶、DMAP，N-甲基吗啉，四甲基乙二胺中的一种。4.所述原料优选以下所示化合物中的一种或几种：筛选出活性好的化合物作为小分子探针研究蓝萼甲素的抗肿瘤机制。还可以将其应用在抑制肿瘤药物中。特别是制备肝癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌、食管癌药物。本专利技术具有以下优点：1、合成了系列以PEG链为连接基团本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种蓝萼甲素衍生物的小分子探针，其特征在于，具有通式1所示结构：/n
【技术特征摘要】
1.一种蓝萼甲素衍生物的小分子探针，其特征在于，具有通式1所示结构：
n＝1,2,3；m＝2,3。
2.如权利要求1所述的蓝萼甲素衍生物的小分子探针，其特征在于：选自如下化合物：
3.一种蓝萼甲素衍生物的小分子探针，其特征在于，具有通式I’所示结构：
n＝1,2,3；m＝2,3。
4.如权利要求3所述的蓝萼甲素衍生物的小分子探针，其特征在于：选自如下化合物：
5.制备如权利要求1或3所述的蓝萼甲素小分子探针的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)：蓝萼甲素与具有式7结构的酸酐溶于有机溶剂中，加入碱，碱性条件下加热回流发生酯化反应得到具...
【专利技术属性】
技术研发人员：白素平，李念先，张涛，海广范，樊高省，马雯，刘玲，
申请(专利权)人：新乡医学院，
类型：发明
国别省市：河南;41
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