本发明专利技术公开了一种转S6RNAi基因抗黑条矮缩病水稻品系WLJ1‑US6‑11‑5的检测方法，属于生物技术领域。本发明专利技术是利用转化体WLJ1‑US6‑11‑5中含外源基因S6RNAi的T‑DNA表达框在水稻染色体上插入片段序列和插入片段RB端旁侧特异序列SEQ ID NO:1，并基于SEQ ID NO:1序列，建立的特异性PCR扩增鉴定技术。PCR所用正向载体引物US‑W1依据SEQ ID NO:1中1‑1178位序列设计，反向基因组引物US‑W2依据SEQ ID NO:1中1179‑2000位序列设计，正向基因组引物US‑W3依据T‑DNA插入位置上游528bp处设计。根据是否扩增得到US‑W1 US‑W2引物组合M、US‑W3 US‑W2引物组合N的目标片段判断株系中是否含外源S6RNAi基因，该PCR方法可作为鉴定转基因水稻品系WLJ1‑US6‑11‑5及该品系的衍生系的有效手段。
A detection method of rice line wlj 1-us6-11-5 with s6rnai gene
【技术实现步骤摘要】
一种转S6RNAi基因抗黑条矮缩病水稻品系WLJ1-US6-11-5的检测方法
本专利技术属于生物
，特别是涉及鉴定S6RNAi基因抗黑条矮缩病水稻品系WLJ1-US6-11-5及其衍生品系的检测方法及其所依赖的转化体特异序列。
技术介绍
水稻是世界主要粮食作物之一，是世界上近一半以稻米为主食的人口的主要粮食作物。水稻也是我国最为重要的粮食作物之一，水稻在生产上的安全与否对于保障我国粮食生产安全起着非常重要的作用。水稻病害是影响我国实现水稻稳产、高产、优产目标的重要因素之一。水稻黑条矮缩病是通过灰飞虱作为其主要传播媒介的一种水稻病毒病，它是由水稻黑条矮缩病毒引起。水稻一旦受该病毒侵染后，基本无法防治，因此黑条矮缩病也被称为水稻上的“癌症”，严重发生时可造成巨大的产量损失。由于缺乏高抗资源和高效的抗病鉴定方法，使得通过传统育种手段难以培育高抗病品种。以转基因技术为核心的分子育种设计技术可以将水稻自身携带的抗性基因以及其他物种的抗性基因导入水稻中，在水稻中过量表达，从而使现有品种获得高抗病特性。目前已经有多个转基因水稻品系获准进入环境释放或生产试验。对转基因作物的有效监管是转基因作物安全利用的重要保障。转基因作物外源序列插入片段旁侧序列是转基因植物品系的最重要的分子身份证。因此，依据外源插入片段的旁侧序列是建立转基因作物品系特异性检测方法的重要技术资料。WLJ1-US6-11-5是江苏省扬州大学研发的抗水稻黑条矮缩病的具有广泛应用前景的转基因水稻品系[邹捷，抗黑条矮缩病转基因水稻育种新材料的创制(D)，扬州大学，2016]。利用插入位点旁侧序列特异性地鉴定转基因品种(品系)是目前鉴定转基因作物最可靠最特异的检测方法，是准确鉴别区分同一转化体及其衍生品系的方法。利用插入位点旁侧序列鉴定转基因品系，该方法己在鉴定Bt汕优63、克螟稻、科丰8号和科丰6号品系中建立。WLJ1-US6-11-5是最新研发的抗黑条矮缩病转基因水稻品系，尚无任何相关转基因水稻WLJ1-US6-11-5外源基因插入片段的旁侧序列文章报道和专利。
技术实现思路
针对现有问题的不足，本专利技术的目的是提供一种转S6RNAi基因抗黑条矮缩病水稻品系WLJ1-US6-11-5的检测方法，以提高区分同一转化体及其衍生品系的鉴别准确度。为实现以上技术目的，本专利技术利用插入位点旁侧序列特异性地鉴定转基因品种(品系)是目前鉴定转基因作物最可靠最特异的检测方法，采用的具体技术方案如下。一种转S6RNAi基因抗黑条矮缩病水稻品系WLJ1-US6-11-5的检测方法，利用转化体WLJ1-US6-11-5中含外源基因S6RNAi的T-DNA表达框在水稻染色体上插入片段序列和插入片段RB端旁侧序列SEQIDNO:1，并基于SEQIDNO:1序列，建立特异性PCR扩增引物；再利用特异性PCR扩增引物进行检测。所述特异性PCR扩增引物包括：正向载体引物US-W1:5'-CTTAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTT-3'；反向基因组引物US-W2:5'-GGTCGAACGAATCAAACATTTTAATAGC-3'；正向基因组引物US-W3:5'-CAGCAGGTTTCAGCCTTGGTTCT-3'，所述的水稻品系为WLJ1-US6-11-5。所述正向载体引物US-W1为依据SEQIDNO:1中1-1178位序列设计的正向载体引物；所述反向基因组引物US-W2为依据SEQIDNO:1中1179-2000位序列设计的反向基因组引物；所述正向基因组引物US-W3为依据T-DNA插入位置上游528bp处设计的正向基因组引物；所述正向载体引物US-W1和反向基因组引物US-W2组合得引物组合M，扩增出的条带大小为405bp的405bp条带；正向基因组引物US-W3和反向基因组引物US-W2组合得引物组合N，扩增出的条带大小为903bp的903bp条带；用引物组合M和引物组合N分别扩增水稻基因组DNA：如果只扩增出所述405bp条带，则表示该植株为含外源S6RNAi基因的纯合体；如果同时能扩增出所述405bp条带和所述903bp条带，则表示该植株为含外源S6RNAi基因的杂合体；如果只扩增出所述903bp条带，则表示该植株不含外源S6RNAi基因。作为本申请的优选技术方案，所述水稻品系WLJ1-US6-11-5包括亲本、衍生品系或品种。作为本申请的优选技术方案，所述PCR反应体系为：模板DNA2.0μL、10×PCRBuffer2.0μL、dNTP0.4μL、正向引物0.4μL、反向引物0.4μL、Taq酶0.2μL、加ddH2O至20μL。作为本申请的优选技术方案，PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性45S，58℃退火45S，72℃延伸1min，38个循环；72℃延伸5min。本领域技术人员熟知，上述特异性PCR引物可通过人工序列合成制备得到，存在状态可以是粉状、或溶液状的。本专利技术还保护用于水稻品系WLJ1-US6-11-5纯杂合鉴定的试剂盒，包括上述的特异性PCR扩增引物。其中，所述试剂盒包括用于进行PCR扩增的常规试剂，和/或用于进行电泳检测的常规试剂。有益效果本专利技术提供了转基因水稻WLJ1-US6-11-5外源基因插入位点的右边界旁侧序列，以及基于这段序列的转化事件特异检测方法。本专利技术证实，通过本专利技术的方法/特异性PCR引物组能够获知WLJ1-US6-11-5的纯杂合类型、是否含有外源S6RNAi基因，为转基因水稻品系WLJ1-US6-11-5及其衍生系提供了分子特征和特异的检测手段。附图说明图1：转化载体pMF-Ubi-S6-35SpolyA的T-DNA区域结构示意图。图2：不同限制性内切酶条件下水稻WLJ1-US6-11-5RB边界反向PCR扩增结果图；US-11-5：WLJ1-US6-11-5；M:DL2000Marker。图3：水稻WLJ1-US6-11-5外源基因插入位点右边界旁侧序列的特异PCR检测引物设计示意图；US-W1、US-W2和US-W3表示用于基因分型的引物；RB和LB分别表示T-DNA的右边界和左边界。图4：水稻WLJ1-US6-11-5外源基因插入旁侧序列特异性定性PCR检测电泳图，正向载体引物US-W1和反向基因组引物US-W2组合得引物组合M，扩增得到405bp条带；正向基因组引物US-W3和反向基因组引物US-W2组合得引物组合N，扩增得到903bp条带，分别采用引物组合M和引物组合N对WLJ1-US6-11-5、非转基因对照WYJ24以及WLJ1-US6-11-5/武陵粳1号的F2代分离群体进行的PCR鉴定，WLJ1-US6-11-5只扩增出405bp条带，非转基因对照WYJ24只扩增出903bp条带，WLJ1-US6-11-5/武陵粳1号的F2分离群体出现只扩增出405bp条带的含外源S6RNAi基因的纯合体、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种转S6RNAi基因抗黑条矮缩病水稻品系WLJ1-US6-11-5的检测方法，其特征在于，利用转化体WLJ1-US6-11-5中含外源基因S6RNAi的T-DNA表达框在水稻染色体上插入片段序列和插入片段RB端旁侧序列SEQ ID NO: 1，并基于SEQ ID NO: 1序列，建立特异性PCR扩增引物；再利用特异性PCR扩增引物进行检测。/n
【技术特征摘要】
1.一种转S6RNAi基因抗黑条矮缩病水稻品系WLJ1-US6-11-5的检测方法，其特征在于，利用转化体WLJ1-US6-11-5中含外源基因S6RNAi的T-DNA表达框在水稻染色体上插入片段序列和插入片段RB端旁侧序列SEQIDNO:1，并基于SEQIDNO:1序列，建立特异性PCR扩增引物；再利用特异性PCR扩增引物进行检测。
2.根据权利要求1所述的一种转S6RNAi基因抗黑条矮缩病水稻品系WLJ1-US6-11-5的检测方法，其特征在于，所述特异性PCR扩增引物包括：
正向载体引物US-W1:5'-CTTAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTT-3'；
反向基因组引物US-W2:5'-GGTCGAACGAATCAAACATTTTAATAGC-3'；
正向基因组引物US-W3:5'-CAGCAGGTTTCAGCCTTGGTTCT-3'。
3.根据权利要求2所述的一种转S6RNAi基因抗黑条矮缩病水稻品系WLJ1-US6-11-5的检测方法，其特征在于，
所述正向载体引物US-W1为依据SEQIDNO:1中1-1178位序列设计的正向载体引物；
所述反向基因组引物US-W2为依据SEQIDNO:1中1179-2000位序列设计的反向基因组引物；
所述正向基因组引物US-W3为依据T-DNA插入位置上游528bp处设计的正向基因组引物；
所...
【专利技术属性】
技术研发人员：左示敏，冯志明，张亚芳，陈宗祥，邹捷，崔傲，李明友，杜海波，潘学彪，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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