一种以含蛋白多糖复合物皮粉为底物的糖苷酶活力测定和性能评价方法技术

本发明专利技术提供了一种以含蛋白多糖复合物皮粉为底物的糖苷酶活力测定和性能评价方法。该方法以天然动物皮为原料，制备含蛋白多糖复合物的皮粉底物；糖苷酶催化皮粉中蛋白多糖复合物水解并从皮粉中溶出，以单位时间内反应液中总糖的产生量来表征酶活力。本发明专利技术的糖苷酶活力表征方法包括以下步骤：（1）底物的制备；（2）糖苷酶活力的测定；（3）糖苷酶活力计算。本方法所用底物含与胶原结合紧密的、难以被普通酸碱破坏的动物皮中原有的蛋白多糖复合物，反应过程模拟了制革、制裘等动物皮加工过程中的固液反应，可以在较宽的pH范围测定不同糖苷酶的活力和性能，测定结果能为制革或制裘生产中糖苷酶的筛选、应用条件的优化和技术的开发提供指导。

A method for the determination of glucosidase activity and the evaluation of its performance based on the skin powder containing proteoglycan complex

【技术实现步骤摘要】
一种以含蛋白多糖复合物皮粉为底物的糖苷酶活力测定和性能评价方法
本专利技术涉及糖苷酶的活力检测方法，具体涉及制革和制裘等动物皮加工利用领域中所使用的糖苷酶的活力测定和性能评价方法及其应用。
技术介绍
蛋白多糖复合物，这里主要包括蛋白多糖和糖蛋白，是动物皮内纤维间质中的主要成分。它们能够使毛粘附于毛囊、胶原分子粘结形成胶原纤维。因此，在制革和制裘生产中必须去除这些物质，以便达到纤维分散和脱毛的效果。研究表明这些物质的去除与皮革或裘皮的质量紧密相关，这些物质的含量越低，皮革或裘皮的柔软度越好。糖苷酶能特异性水解蛋白多糖复合物中的糖苷键，因此能在温和的条件下有效破坏并去除蛋白多糖复合物。另一方面，糖苷酶能够水解其中的糖链而不水解蛋白，比蛋白酶更安全。研究表明α-淀粉酶和α-半乳糖苷酶能够促进纤维分散，提高成革柔软度，木聚糖酶能够去除皮垢和皮上的色素，获得粒面洁白的皮革。实际上，能够水解糖苷键的糖苷酶是一个巨大的家族，有超过200类糖苷酶，因此具有巨大的开发潜力。可以从其中筛选合适的糖苷酶并开发更清洁、价廉、高效的去除蛋白多糖复合物的糖苷酶技术。不同的糖苷酶对不同的蛋白多糖复合物具有水解特异性，包括糖苷键、组成糖苷键的糖基和糖基配体的特异性。为了筛选合适的糖苷酶应用于制革和制裘领域，需要评价具有不同底物特异性的糖苷酶对动物皮内蛋白多糖复合物的水解活力。但目前糖苷酶的活力测定和性能评价方法中使用的底物都是基于其应用领域如食品、饲料、纺织和酿造工业等，例如以淀粉为底物评价淀粉酶的活力，以滤纸为底物评价纤维素酶活力，以木聚糖为底物评价木聚糖酶活力。这些底物与动物原料皮中具有三维空间结构的胶原微原纤维复合在一起的蛋白多糖复合物结构差异巨大，因此现有方法并不能反映糖苷酶对皮内蛋白多糖复合物的实际去除效果，也不能指导其实际应用。此外，这些方法所测定的不同种类的糖苷酶活力之间不能相互比较。
技术实现思路
为填补目前尚未有适合制革、制裘等动物皮加工利用领域的糖苷酶活力测定方法的空白，使不同糖苷酶的水解效果具有可比性，本专利技术提供了一种以含蛋白多糖复合物皮粉为底物的糖苷酶活力测定和性能评价方法。该方法以含动物皮内原有的蛋白多糖复合物的皮粉为底物，通过测定糖苷酶水解皮粉中蛋白多糖复合物后反应液中可溶性总糖的增加量来表征酶活力。本专利技术的另一目的在于根据所述检测糖苷酶活力的方法，从而优选出能有效去除皮内蛋白多糖复合物的糖苷酶，应用于制革和制裘生产过程，促进纤维分散和脱毛、促进制革和制裘清洁生产并获得高质量皮革或裘皮。可实现上述专利技术目的一种以含蛋白多糖复合物皮粉为底物的糖苷酶活力测定和性能评价方法，包括以下步骤：1）含蛋白多糖复合物皮粉底物的制备：取保存较好的动物皮（如猪皮、羊皮和牛皮等，包括新鲜的、盐腌的或冷冻保存的动物皮等）100份，充分水洗，去肉、脱脂后剖层，取厚约0.5-1.5mm的粒面层，称重后放入转鼓或振荡器中，加入清水100-400份，防腐剂0-0.5份，在15-25℃下浸泡或间隙转动3-12h，再用300-500份水洗涤3次，每次30min，然后进行去毛，将皮切成小块，自然干燥或冷冻干燥后用皮革碾磨仪打成皮粉，并过50-150目筛，然后加入100-800份洗涤液反复洗涤，直到上清液中的总糖含量低于检测限，将皮粉再次干燥，得到含糖量0.01%-2%的皮粉底物；2)糖苷酶活力的测定：准确称取含蛋白多糖复合物的皮粉底物0.1-5g，加入锥形瓶中，加入皮粉质量10-50倍的缓冲液，在水浴振荡器中于设定的温度下保温并振荡5-240min使皮粉完全润湿；将待测糖苷酶的样品用相应的缓冲溶液溶解，经过离心去除不溶性杂质，经过超滤和/或柱层析去除分子量低于5000Da的可溶性杂质，再将酶液稀释至适当的倍数，使酶液的活力浓度为1-50U/mL，将酶液在预设的温度中预热5min，然后加入1mL待测酶溶液，在设定温度下振荡反应0.5-4h，再加入1mL的1-6mol/L的硫酸溶液将pH值快速调至3.0以下，终止酶反应。空白对照样为在反应样的终止操作的同时，加入1mL1-6mol/L硫酸溶液和1mL酶溶液，其他操作和酶反应实验完全相同；反应终止后立即于转速5000-12000rpm，温度4℃条件下离心10-20min，取上清液用去离子水稀释至适当的倍数，然后按照以下方法测上清液中总糖含量；具体为：取2mL经适当稀释的样品，加入1mL浓度为6%的苯酚溶液，混匀后立即沿试管壁以一定速度加入5mL浓硫酸，静置10min后混匀，90℃保温静置30min后，然后冷却至室温，测定490nm处吸光度值，并以稀释至不同浓度的葡萄糖溶液做出相应的标准曲线，根据标准曲线计算产物的量；3）糖苷酶活力的计算糖苷酶活力定义：1g固体酶（或1mL液体酶），在一定条件下（温度和pH值）水解皮粉中蛋白多糖复合物，每分钟产生1μg总糖，即为1个活力单位，以U/g或U/mL表示；糖苷酶活力U=（U/g或U/mL）式中A1：根据实验组OD值计算得到的反应样液中的总糖含量，μg/mL；A2：根据空白组OD值计算得到的反应样液中的总糖含量，μg/mL；V：反应体系的总体积mL；N：酶样品的稀释倍数。上述技术方案中，用于制备底物皮粉的动物皮为各种适合制革和制裘用的原料皮，优选地选用动物皮中蛋白多糖复合物含量高的粒面层，即最上层处厚度约0.5-1.5mm的皮层。上述技术方案中，制备的皮粉底物含有动物皮中原有的且结合牢固的蛋白多糖复合物，含糖量0.01%-2%，皮粉的目数为50-150目。上述技术方案中，溶解酶和稀释酶液所用的缓冲液为伯瑞坦-罗宾森缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液、磷酸二氢钠-氢氧化钠缓冲液或者Tris-HCl缓冲液；待测酶液经过离心、超滤和/或柱层析去除去除不溶性及分子量低于5000Da的可溶性杂质，特别是含糖成分的杂质。上述技术方案中，底物用量为0.1-5g，最优用量为2g；反应时间为0-4小时，最优为2小时；加入糖苷酶溶液的活力浓度为1-50U/mL，优选为5-35U/mL；pH值为2-14；反应温度为5-55℃。本专利技术还提供了一种上述方法的应用，上述方法适用于在制革、制裘等动物皮加工利用领域中测定各种糖苷酶对动物皮中的蛋白多糖复合物水解活力及性能。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术建立了一种表征糖苷酶活力的评价方法，解决了目前基于食品、饲料、酿造等领域的不同种类的具有不同水解特异性的糖苷酶活力测试中使用不同底物、活力结果相互之间不能比较的问题，填补了制革、制裘等动物皮加工利用领域中糖苷酶活力和性能表征方法的空白，拓宽了各种糖苷酶的应用领域。底物针对性强，皮粉底物中的蛋白多糖复合物成分为动物皮中原有成分，反应条件与动物皮处理过程中酶对皮内蛋白多糖复合物作用的条件相近，测定结果对以动物皮为原料的制革、制裘等动物皮加工利用领域糖苷酶的选择和应用条件的优化具有指导意义。该方法通过本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种以含蛋白多糖复合物皮粉为底物的糖苷酶活力测定和性能评价方法，其特征在于所述方法包括以下步骤，所用材料按照质量份计；/n（1）含蛋白多糖复合物皮粉底物的制备/n取保存较好的动物皮100份，充分水洗，去肉、脱脂后剖层，取厚约0.5-1.5 mm的粒面层，称重后放入转鼓或振荡器中，加入清水100-400份，防腐剂0-0.5份，在15-25 ℃下浸泡或间隙转动3-12 h，再用300-500份水洗涤3次，每次30 min，然后进行去毛，将皮切成小块，自然干燥或冷冻干燥后用皮革碾磨仪打成皮粉，并过50-150目筛，然后加入100-800份洗涤液反复洗涤，直到上清液中的总糖含量低于检测限，将皮粉再次干燥，得到含糖量0.01%-2%的皮粉底物；/n（2）糖苷酶活力的测定/n准确称取含蛋白多糖复合物的皮粉底物0.1-5g，加入锥形瓶中，加入皮粉质量10-50倍的缓冲液，在水浴振荡器中于设定温度下保温并振荡5-240 min使皮粉完全润湿；/n将待测糖苷酶的样品用相应的缓冲溶液溶解，经过离心去除不溶性杂质，经过超滤和/或柱层析去除分子量低于5000 Da的可溶性杂质，再将酶液稀释至适当的倍数，使酶液的活力浓度为1-50 U/mL，酶液在预设温度的水浴中预热5 min，加入1 mL待测酶溶液于锥形瓶中，在设定温度下振荡反应0.5-4 h后，加入1 mL的1-6 mol/L的硫酸溶液将pH快速调至3.0以下，终止酶反应；空白对照样是在反应样的终止操作的同时，加入1mL的1-6 mol/L硫酸溶液和1mL酶溶液，其他操作和酶反应实验完全相同；/n反应终止后立即于转速5000-12000 rpm，温度4 ℃条件下离心10-20 min，取上清液稀释至适当的倍数，然后按照以下方法测上清液中总糖含量；具体为：取2 mL 经适当稀释的样品，加入1mL 浓度为6%的苯酚溶液，混匀后立即沿试管壁以一定速度加入5 mL浓硫酸，静置10 min后混匀，90℃保温静置30min后，然后冷却至室温，测定490 nm处吸光度值，并以稀释至不同浓度的葡萄糖标准溶液做出相应的标准曲线，根据标准曲线计算产物的量；/n（3）糖苷酶活力的计算/n糖苷酶活力定义：1g固体酶或1mL液体酶，在一定温度和pH值条件下水解皮粉中蛋白多糖复合物，每分钟产生1μg总糖，即为1个活力单位，以U/g或U/mL表示；/n糖苷酶活力...

【技术特征摘要】
1.一种以含蛋白多糖复合物皮粉为底物的糖苷酶活力测定和性能评价方法，其特征在于所述方法包括以下步骤，所用材料按照质量份计；
（1）含蛋白多糖复合物皮粉底物的制备
取保存较好的动物皮100份，充分水洗，去肉、脱脂后剖层，取厚约0.5-1.5mm的粒面层，称重后放入转鼓或振荡器中，加入清水100-400份，防腐剂0-0.5份，在15-25℃下浸泡或间隙转动3-12h，再用300-500份水洗涤3次，每次30min，然后进行去毛，将皮切成小块，自然干燥或冷冻干燥后用皮革碾磨仪打成皮粉，并过50-150目筛，然后加入100-800份洗涤液反复洗涤，直到上清液中的总糖含量低于检测限，将皮粉再次干燥，得到含糖量0.01%-2%的皮粉底物；
（2）糖苷酶活力的测定
准确称取含蛋白多糖复合物的皮粉底物0.1-5g，加入锥形瓶中，加入皮粉质量10-50倍的缓冲液，在水浴振荡器中于设定温度下保温并振荡5-240min使皮粉完全润湿；
将待测糖苷酶的样品用相应的缓冲溶液溶解，经过离心去除不溶性杂质，经过超滤和/或柱层析去除分子量低于5000Da的可溶性杂质，再将酶液稀释至适当的倍数，使酶液的活力浓度为1-50U/mL，酶液在预设温度的水浴中预热5min，加入1mL待测酶溶液于锥形瓶中，在设定温度下振荡反应0.5-4h后，加入1mL的1-6mol/L的硫酸溶液将pH快速调至3.0以下，终止酶反应；空白对照样是在反应样的终止操作的同时，加入1mL的1-6mol/L硫酸溶液和1mL酶溶液，其他操作和酶反应实验完全相同；
反应终止后立即于转速5000-12000rpm，温度4℃条件下离心10-20min，取上清液稀释至适当的倍数，然后按照以下方法测上清液中总糖含量；具体为：取2mL经适当稀释的样品，加入1mL浓度为6%的苯酚溶液，混匀后立即沿试管壁以一定速度加入5mL浓硫酸，静置10min后混匀，90℃保温静置30min后，然后冷却至室温，测定490nm处吸光度值，并以稀释至不同浓度的葡萄糖标准溶液做出相应的标准曲线，根据标准曲线计算产物的量；
（3）糖苷酶活力的计算
糖苷酶活力定义：1g固体酶或1mL液体酶，在一定温度和pH值条件下水解皮粉中蛋白多糖复合物，每分钟产生1μg...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭必雨，罗凤香，钟祥，高蒙初，张春晓，龙忠珍，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川;51