一种cGAMP生物合成方法技术

本发明专利技术公开了一种cGAMP生物合成方法。本发明专利技术提供了一种合成cGAMP的方法，为用核苷转移酶cGAS和蛋白G3BP1催化反应缓冲液中的ATP、GTP和DNA，收集反应产物，即得到合成的cGAMP；所述反应缓冲液包括ATP、GTP和DNA。本发明专利技术的实验证明，蛋白G3BP1能促进核苷转移酶cGAS催化ATP、GTP和DNA合成cGAMP，与已报道的cGAS催化ATP、GTP和DNA合成cGAMP方法相比，能够显著提高cGAMP的合成效率。

A method of cgamp biosynthesis

【技术实现步骤摘要】
一种cGAMP生物合成方法
本专利技术属于生物
，尤其涉及一种cGAMP生物合成方法。
技术介绍
DNA感受器(DNAsensors)是机体识别侵染细胞的病毒DNA并激活免疫反应的关键蛋白质。cGAS是2013年被鉴定到的一个胞内DNA感受器，被认为是DNA介导I型干扰素产生的最主要受体。cGAS作为一种核苷转移酶，催化ATP和GTP形成小分子第二信使cGAMP(CyclicGMP-AMP)，进而启动I型干扰素等炎性细胞因子的表达，从而启动免疫反应。因此，cGAMP被认为是可以用来调节人体免疫反应的理想药物分子，用于增强人体的抵抗感染能力，以及用于肿瘤的免疫治疗。cGAMP分子式如下：已知的cGAMP生物合成方法是：
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种合成cGAMP的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤：在蛋白G3BP1和DNA的作用下，用核苷转移酶cGAS催化底物ATP和GTP，合成cGAMP。上述方法中，底物为ATP和GTP；酶为核苷转移酶cGAS；DNA的作用是激活核苷转移酶；蛋白G3BP1的作用是提高酶催化活性。上述方法中，所述cGAS、所述G3BP1、所述ATP、所述GTP和所述DNA的配比为8μg：8μg：100nM：100nM：1μg。上述方法中，本专利技术使用的DNA与现有技术中用cGAS催化ATP、GTP和DNA反应生成的cGAMP的技术中的DNA相同。本领域技术人员根据现有技术很容易选择相应的DNA。本专利技术使用的DNA长度为大于45bp的双链DNA(至万bp均可用)。作为本专利技术的一个实施例，使用的DNA为HT-DNA,大于2000bp本专利技术采用的是Sigma-Aldrich公司的，货号为D6898)。上述方法中，所述底物ATP、GTP和DNA存在于反应缓冲溶液中；所述反应缓冲液包括ATP、GTP、DNA、MgCl2和HEPES；所述cGAS、所述G3BP1、所述ATP、所述GTP、所述DNA、所述MgCl2和所述HEPES的配比为8μg：8μg：100nmol：100nmol：1μg：250nmol：1μmol。上述方法中，所述反应缓冲液由5mMMgCl2、2mMATP、2mMGTP、0.02mg/mlDNA、20mMHEPES和水组成；且所述反应缓冲液的pH值为7.5。上述方法中，所述在蛋白G3BP1和DNA的作用下，用核苷转移酶cGAS催化底物ATP和GTP，合成cGAMP的方法包括如下步骤：将所述核苷转移酶cGAS和所述蛋白G3BP1溶解在所述反应缓冲液中，反应，得到cGAMP。上述方法中，所述反应的时间为1小时，所述反应的温度为37度。上述方法中，在所述催化后，还包括如下步骤：用甲醇和乙腈萃取催化得到的产物，收集上清液，干燥后得到cGAMP。上述蛋白G3BP1在促进核苷转移酶cGAS催化底物ATP、GTP和DNA合成cGAMP中的应用也是本专利技术保护的范围。上述蛋白G3BP1在提高核苷转移酶cGAS催化底物ATP、GTP和DNA合成cGAMP产量中的应用也是本专利技术保护的范围。本专利技术另一个目的是提供一种提高cGAMP产量的方法。本专利技术提供的方法，为上述合成cGAMP的方法；所述cGAMP产量高于仅用核苷转移酶cGAS催化ATP、GTP和DNA合成的cGAMP产量。上述蛋白质cGAS可为人源(序列1)或者鼠源(序列3)或者猪源(序列4)或者cGAS_Bovin(序列5)，各个蛋白均可通过原核表达系统利用HisTrap(GEHealthcare,17-5248-01)纯化；上述蛋白质G3BP1可为人源(序列1)或者鼠源(序列6)或者G3BP1_Bovin(序列7)，各个蛋白均可通过原核表达系统利用HisTrap(GEHealthcare,17-5248-01)纯化。本专利技术中的名词注释如下：HEPES:4-羟乙基哌嗪乙磺酸MgCl2:氯化镁HT-DNA：鲱鱼基因组DNAATP：腺嘌呤核苷三磷酸GTP：鸟嘌呤核苷三磷酸LC-MS/MS：液相色谱质谱/质谱联用本专利技术的实验证明，蛋白G3BP1能促进核苷转移酶cGAS催化ATP、GTP和DNA合成cGAMP，与已报道的cGAS催化ATP、GTP和DNA合成cGAMP方法相比，能够显著提高cGAMP的合成效率。附图说明图1为cGAMP产量检测结果。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中蛋白质cGAS可为人源(序列1)或者鼠源(序列3)或者猪源(序列4)或者cGAS_Bovin(序列5)，各个蛋白均可通过原核表达系统利用HisTrap(GEHealthcare,17-5248-01)纯化；蛋白质G3BP1可为人源(序列2)或者鼠源(序列6)或者G3BP1_Bovin(序列7)，各个蛋白均可通过原核表达系统利用HisTrap(GEHealthcare,17-5248-01)纯化。下述实施例中反应缓冲液为由5mMMgCl2、2mMATP、2mMGTP、0.02mg/mlHT-DNA、20mMHEPES和水组成，其pH值为7.5。下述实施例中缺DNA的反应缓冲液为由5mMMgCl2、2mMATP、2mMGTP、20mMHEPES和水组成，其pH值为7.5。实施例1、G3BP1在提高cGAMP产量中的应用本实施例中的采用的合成方法流程如下：具体合成方法如下：1、合成cGAMP合成cGAMP的方法为如下4组:ATP+GTP+DNA+cGAS+G3BP1组：将蛋白质cGAS(8μg)与G3BP1(8μg)混合，在反应缓冲液50μL(20mMHEPES,pH7.5；5mMMgCl2；2mMATP；2mMGTP；0.02mg/mlHT-DNA)中反应1小时(37℃)，得到含有cGAMP的反应产物；ATP+GTP+cGAS+G3BP1组：将蛋白质cGAS(8μg)与G3BP1(8μg)混合，在缺DNA的反应缓冲液50μl(20mMHEPES,pH7.5；5mMMgCl2；2mMATP；2mMGTP)中反应2小时(37℃)，得到含有cGAMP的反应产物；ATP+GTP+DNA+G3BP1组：将蛋白质G3BP1(8μg)在反应缓冲液50μl(20mMHEPES,pH7.5；5mMMgCl2；2mMATP；2mMGTP；0.02mg/mlHT-DNA)中反应2小时(37℃)，得到含有cGAMP的反应产物；ATP+GTP+DNA+cGAS组：将蛋白质cGAS(8μg)在反应缓冲液50μL(20mMHEPES,pH7.5；5mMMgCl2；2mMAT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种合成cGAMP的方法，包括如下步骤：在蛋白G3BP1和DNA的作用下，用核苷转移酶cGAS催化底物ATP和GTP，合成cGAMP。/n

【技术特征摘要】
1.一种合成cGAMP的方法，包括如下步骤：在蛋白G3BP1和DNA的作用下，用核苷转移酶cGAS催化底物ATP和GTP，合成cGAMP。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述cGAS、所述G3BP1、所述ATP、所述GTP和所述DNA的配比为8μg：8μg：100nM：100nM：1μg。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述底物ATP、GTP和DNA均存在于反应缓冲溶液中；
所述反应缓冲液包括ATP、GTP、DNA、MgCl2和HEPES；
所述cGAS、所述G3BP1、所述ATP、所述GTP、所述DNA、所述MgCl2和所述HEPES的配比为8μg：8μg：100nmol：100nmol：1μg：250nmol：1μmol。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述反应缓冲液由5mMMgCl2、2mMATP、2mMGTP、0.02mg/mlDNA、20mMHEPES和水组成；且所述反应缓冲液的pH值为7.5。


5.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：张学敏，李涛，周涛，李爱玲，何昆，刘朝山，夏天，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11