一种四环素类抗生素降解基因tet(X)的优化及其在真核表达系统中的应用技术方案

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉及一种四环素类抗生素降解基因tet(X)的优化及其在真核表达系统中的应用，为构建一种可分泌四环素类抗生素降解酶的真核表达系统，从而为四环素类抗生素的降解提供了一种新的途径，本发明专利技术在基因tet(X)序列的基础上经过优化得到适用于真核表达系统的tet(X)

Optimization of a tetracycline antibiotic degradation gene tet (x) and its application in eukaryotic expression system

【技术实现步骤摘要】
一种四环素类抗生素降解基因tet(X)的优化及其在真核表达系统中的应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种四环素类抗生素降解基因tet(X)的优化及其在真核表达系统中的应用。
技术介绍
四环素类抗生素包括四环素、土霉素、金霉素等，是一类广谱抗生素，被广泛应用于人类及动物疾病的防治，同时也被作为饲料添加剂应用于禽畜养殖业和水产养殖业中。四环素类抗生素结构复杂，含并四苯骨架，属于难生物降解物质，很容易在环境中富集，在动物体内，四环素仅有部分被吸收并发生代谢，大部分以活性形式(母体或代谢产物)随粪便和尿液排出体外，进入生态环境。目前，四环素类抗生素在家畜和人群中均使用广泛，因其较低的吸收率导致四环素类抗生素的残留问题十分严峻，四环素类抗生素的残留对环境、家畜和人类健康发展均造成重大威胁。当前，降解四环素类抗生素的方式主要有以下两种：一是生物降解，包括微生物降解和植物降解；二是非生物降解，如水解、氧化降解及光降解等。近期，四环素降解基因tet(X)新亚型的发现，为解决四环素的残留问题提供一些新思路。tet(X)可编码一种依赖于黄素的单加氧酶，该酶在O2、NADPH、MgCl2的参与下可以高效降解四环素类抗生素。随着分子生物学的发展，通过基因工程的方法，以微生物为生物容器来合成功能蛋白具有广阔的前景。而在众多的表达宿主中，原核表达产量低，且有可能形成包涵体，不利于功能蛋白的分离纯化，且会增加分离纯化的成本。毕赤酵母是最近迅速发展的一种真核表达宿主，营养要求不高，适合于高密度发酵的大规模生产方式，其分泌自身的蛋白很少，有利于表达产物的分离和纯化。因此，通过分子生物学手段和遗传工程技术，有望通过基因tet(X)和毕赤酵母构建一种可降解四环素类抗生素的工程酵母，从而为四环素类抗生素的降解提供了一种新的途径。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的不足，本专利技术的首要目的是提供一种编码四环素类抗生素降解酶的优化基因tet(X)*。本专利技术的第二个目的是提供一种能分泌四环素类抗生素降解酶Tet(X)的工程酵母。本专利技术的第三个目的是提供一种能分泌四环素类抗生素降解酶Tet(X)的工程酵母的构建方法。本专利技术的第四个目的是提供上述工程酵母在降解四环素类抗生素中的应用。为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案为：本专利技术提供一种编码四环素类抗生素降解酶的优化基因tet(X)*，该基因由tet(X)基因优化而来，优化后的tet(X)*适用于真核表达系统，该优化基因具有如SEQIDNO：2所示的核苷酸优化序列。Tet(X)是一种依赖于黄素的单加氧酶，该酶在O2、NADPH、MgCl2的参与下可以高效降解四环素类抗生素。本专利技术的编码四环素类抗生素降解酶的优化基因tet(X)*是在tet(X)原序列(如SEQIDNO：1所示)的基础上进行优化后得到的，优化后的tet(X)*基因在真核表达体系中具有更高的表达水平。优化的原则为：(1)替换表达宿主细胞的稀有密码子，尽可能使用宿主在蛋白翻译时的高频密码子；(2)为防止mRNA提前终止转录，优化时避免产生AT富含区；(3)尽可能提升序列的GC含量，有利于外源基因tet(X)*的表达；(4)避免优化序列时产生EcoRI、NotI、SalI酶切位点；(5)替换使mRNA不稳定的序列和结构。本专利技术还提供一种能分泌四环素类抗生素降解酶Tet(X)的工程酵母，该工程酵母含有上述的优化基因tet(X)*。四环素降解基因tet(X)可编码一种依赖于黄素的单加氧酶，该酶在O2、NADPH、MgCl2的参与下可以高效降解四环素类抗生素。毕赤酵母是最近迅速发展的一种真核表达宿主，营养要求不高，适合于高密度发酵的大规模生产方式，其分泌自身的蛋白很少，有利于表达产物的分离和纯化。将从tet(X)优化后得到的tet(X)*基因导入到毕赤酵母中构建工程酵母，可以为四环素类抗生素的降解提供新的途径。本专利技术还提供一种能分泌四环素类抗生素降解酶Tet(X)的工程酵母的构建方法，以上述优化基因tet(X)*为目的基因，以pPIC9K为载体，以毕赤酵母GS115为宿主，通过基因工程手段获得。毕赤酵母GS115是真核表达系统常用的宿主，有着众多的技术优势。同原核表达相比，GS115可以对外源基因编码的蛋白质进行加工、折叠以及蛋白质修饰，且GS115染色体可以整合多个外源基因的拷贝数，从而在甲醇的严格诱导下能表达出更高水平的蛋白质。本专利技术选用pPIC9K质粒作为载体主要有以下几个方面的考量：(1)pPIC9K载体的HIS4可与毕赤酵母GS115的缺陷型HIS4发生同源重组，从而使酵母获得自身合成氨基酸的能力，便于使用无氨基酵母氮源的培养基筛选转化子；(2)pPIC9K载体上的分泌肽信号可以诱导其信号肽下游的蛋白质分泌至宿主体外，而GS115自身分泌的胞外蛋白较少，故发酵液中的蛋白质主要为外源基因所编码的蛋白质，从而使构建得到的工程酵母表达系统具有初步纯化蛋白的效果。优选的，上述工程酵母的构建方法，包括以下步骤：S1、将优化基因tet(X)*插入到pPIC9K质粒中，构建重组质粒；S2、将毕赤酵母GS115制备成GS115感受态细胞(GS115感受态现制现用，避免冻融)；S3、将步骤S1的重组质粒转化到步骤S2的GS115感受态细胞中，筛选阳性转化子(电转完后，30℃静止培养1h后再涂布筛选)得到工程酵母。优选的，在上述构建方法中，步骤S1的重组质粒在转化前先进行线性化处理，得到线性化重组质粒后再将其转化到步骤S2的GS115感受态细胞中。因为pPIC9K-tet(X)*的完全线性化使得其更容易与GS115的染色体组上的基因发生同源重组。具体的，上述线性化处理方法为：采用SalI限制性内切酶对重组质粒进行单酶切。更优选的，步骤S1的重组质粒在线性化处理前需先转化到感受态细胞DH5α中进行验证和表达，以验证重组质粒是否构建成功，并使其满足后续的浓度需求。优选的，在上述构建方法中，步骤S2的GS115感受态细胞在制备过程中使用了1M的DTT(二硫苏糖醇)。以提高感受态细胞的电转效率。同时，GS115感受态在制备时菌量要足够，制备后的感受态较粘稠，涂布至平板时可见一层薄膜。优选的，在上述构建方法中，步骤S3采用电转化法将重组质粒转化到GS115感受态细胞中，电转化需要足够高的电压和足够长的放电时间，因此，本专利技术的电转化所采用的电击电压为1500-2000V，放电时间为4-6ms。优选的，在上述构建方法中，重组质粒的构建方法为：将优化后的tet(X)*基因插入到pPIC9K载体的EcoRI酶切位点和NotI酶切位点之间。酶切位点的选择原则是：选择目的基因上没有，而质粒的多克隆位点上有的酶切位点，同时要避免切出平末端，并保证该酶切位点仅存在于多克隆位点区，避免切割质粒骨架其他开放阅读框。优选的，在上述构建方法中，步骤S3所述筛选阳性转化子的原则为：先使用不含G418抗性的MD空白板本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种编码四环素类抗生素降解酶的优化基因tet(X)

【技术特征摘要】
1.一种编码四环素类抗生素降解酶的优化基因tet(X)*，其特征在于，该基因具有如SEQIDNO：2所示的核苷酸优化序列。


2.一种能分泌四环素类抗生素降解酶Tet(X)的工程酵母，其特征在于，该工程酵母含有权利要求1所述的优化基因tet(X)*。


3.一种能分泌四环素类抗生素降解酶Tet(X)的工程酵母的构建方法，其特征在于，以权利要求1所述的优化基因tet(X)*为目的基因，以pPIC9K为载体，以毕赤酵母GS115为宿主，通过基因工程手段获得。


4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将优化基因tet(X)*插入到pPIC9K质粒中，构建重组质粒；
S2、将毕赤酵母GS115制备成GS115感受态细胞；
S3、将步骤S1的重组质粒转化到步骤S2的GS115感受态细胞中，筛选阳性转化子得到工程酵母。


5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤S1的重组质粒在转...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙坚，贺骞，余军军，崔超月，陈冲，廖晓萍，刘雅红，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44