一种D-甘油醛的生产方法技术

本发明专利技术公开了一种D‑甘油醛的生产方法，其通过糖醇氧化酶AldO将甘油转化为D‑甘油醛，所述糖醇氧化酶AldO，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明专利技术获得了天蓝色链霉菌的糖醇氧化酶AldO的氨基酸序列，通过密码子优化，并将其表达在大肠杆菌细胞中。该酶能够将廉价的甘油转化为D‑甘油醛，并且具有很好的催化效率，反应条件温和，操作简单，这对通过基因重组合表达技术的大规模工业化应用生产十分有利。

A production method of D-glyceraldehyde

【技术实现步骤摘要】
一种D-甘油醛的生产方法
本专利技术属于D-甘油醛生产
，具体涉及一种D-甘油醛的生产方法。
技术介绍
甘油醛(glyceraldehyde)是一种最早发现的具有光学活性的醛糖化合物，根据其光学活性不同可分为D-甘油醛和L-甘油醛。甘油醛能够作为多种糖类化合物合成的重要前体，比如磷酸二羟基丙酮(DHAP)依赖型醛缩酶L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶(RhaD)能够以D-甘油醛为受体，合成D-山梨糖和D-阿洛酮糖；D-阿洛酮糖是近年发现的一种具有特殊保健功能的新型功能性稀少糖，它的甜度相当于果糖的70％，能量只有蔗糖的0.3％，具有低能量、改善肠道菌群、降低血糖、抗龋齿等生理功能。2011年美国FDA已经批准D-阿洛酮糖可以作为食品添加剂使用，自此D-阿洛酮糖得到了迅速发展，市场上出现了多种含D-阿洛酮糖的产品，2012年松谷化学在日本国内发售添加有13％～15％比例的D-阿洛酮糖、阿洛糖等3种以上的稀少糖糖浆产品(Rare-sugarsweet(简称RSS))，受到消费者欢迎。甘油醛的制备方法有化学法和生物法。但是，由于生物法报道较少，目前市场上销售的D-甘油醛大部分是通过化学方法生产而来。相比生物法，化学方法具有成本高、耗能大、产量低并且不具有立体选择性等缺点。利用生物法生产甘油醛，环境温和、产量高、方法简便而且产物具有立体选择性，因此越来越受到关注。
技术实现思路
本部分的目的在于概述本专利技术的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和专利技术名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和专利技术名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本专利技术的范围。鉴于上述的技术缺陷，提出了本专利技术。因此，作为本专利技术其中一个方面，本专利技术克服现有技术中存在的不足，提供一种D-甘油醛的生产方法。为解决上述技术问题，本专利技术提供了如下技术方案：一种D-甘油醛的生产方法，其包括，通过糖醇氧化酶AldO将甘油转化为D-甘油醛，所述糖醇氧化酶AldO，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。作为本专利技术所述的D-甘油醛的生产方法的一种优选方案：包括，将重组质粒pET28a-AldO转化到Rosetta(DE3)感受态细胞，制备得到AldO的表达菌株。作为本专利技术所述的D-甘油醛的生产方法的一种优选方案：还包括，在含卡那霉素的LB培养基平板上划线，次日挑取单菌落接种于5mL含卡那霉素的LB培养基，37℃，200rpm过夜培养，以1％的接种量接入50mLLB培养基中，37℃，200rpm继续培养2～3h；待培养物OD600＝0.6～0.8时，加入IPTG，使其终浓度为0.1mmol/L，16℃，200rpm过夜培养，6000rpm离心收集菌体，用0.85％的氯化钠溶液洗涤，用5mL无菌水重悬菌体，超声破碎，12000rpm离心收集上清液，用镍柱进行纯化。作为本专利技术所述的D-甘油醛的生产方法的一种优选方案：所述卡那霉素终浓度为50μg/mL。作为本专利技术所述的D-甘油醛的生产方法的一种优选方案：所述糖醇氧化酶AldO，其适宜反应温度为25～45℃。作为本专利技术所述的D-甘油醛的生产方法的一种优选方案：所述糖醇氧化酶AldO，其最适反应温度为30～40℃。作为本专利技术所述的D-甘油醛的生产方法的一种优选方案：所述糖醇氧化酶AldO，其最适反应温度为35℃。作为本专利技术所述的D-甘油醛的生产方法的一种优选方案：所述糖醇氧化酶AldO，其其适宜反应pH值为7.0～8.0。作为本专利技术所述的D-甘油醛的生产方法的一种优选方案：所述糖醇氧化酶AldO，其其适宜反应pH值为7.5。本专利技术的有益效果：本专利技术来源于天蓝色链霉菌的糖醇氧化酶AldO，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术获得了天蓝色链霉菌的糖醇氧化酶AldO的氨基酸序列，通过密码子优化，并将其表达在大肠杆菌细胞中。该酶能够将廉价的甘油转化为D-甘油醛，并且具有很好的催化效率，反应条件温和，操作简单，这对通过基因重组合表达技术的大规模工业化应用生产十分有利。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：图1为转化甘油和焦磷酸生成D型稀有己酮糖的体外多酶分子机器催化途径的示意图；其中，RhaD，L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶；GPO，甘油磷酸氧化酶；Catalase过氧化氢酶；PhoN-Sf，酸性磷酸酶；AldO，糖醇氧化酶。图2为SDS-PAGE检测5个关键酶；A为酸性磷酸酶；B为糖醇氧化酶；C为甘油磷酸氧化酶；D为L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶；E为L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶。第1列为蛋白Maker；第2列,诱导前全细胞；第3列,诱导后全细胞；第4列,细胞破碎液上清；第5列，纯化后蛋白。图3为用HPLC检测以甘油为底物，L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶为醛缩酶，经过酶促反应后的产物。图4为单次利用L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶转化甘油生成D型稀有己酮糖的体外多酶分子催化体系的时间效应曲线。图5为转化甘油和焦磷酸生成D型稀有己酮糖的体外多酶分子催化途径的示意图；其中，FucA，L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶；GPO，甘油磷酸氧化酶；Catalase过氧化氢酶；PhoN-Sf，酸性磷酸酶；AldO，糖醇氧化酶。图6为用HPLC检测以甘油为底物，L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶为醛缩酶，经过酶促反应后的产物。图7为单次利用L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶转化甘油生成D型稀有己酮糖的体外多酶分子催化体系的时间效应曲线。图8为糖醇氧化酶AldO的表达纯化及活性测定。图9为糖醇氧化酶AldO的最适反应温度和最适pH测定。具体实施方式为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本专利技术的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本专利技术，但是本专利技术还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本专利技术内涵的情况下做类似推广，因此本专利技术不受下面公开的具体实施例的限制。其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本专利技术至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。实验材料：甘油，国药集团化学试剂有限公司，产品编号：100106193；焦磷酸二氢二钠，阿拉丁试剂有限公司，产品编号D165310；焦磷酸四钠，阿拉丁试剂有限公司，产品编号S165317；过氧化氢酶，上海生工有限公司产品，产品编号A001896；pET28a载体，Novagen，Mad本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种D-甘油醛的生产方法，其特征在于：通过糖醇氧化酶AldO将甘油转化为D-甘油醛，所述糖醇氧化酶AldO，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种D-甘油醛的生产方法，其特征在于：通过糖醇氧化酶AldO将甘油转化为D-甘油醛，所述糖醇氧化酶AldO，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。


2.如权利要求1所述的D-甘油醛的生产方法，其特征在于：包括，将重组质粒pET28a-AldO转化到Rosetta(DE3)感受态细胞，制备得到AldO的表达菌株。


3.如权利要求2所述的D-甘油醛的生产方法，其特征在于：还包括，在含卡那霉素的LB培养基平板上划线，次日挑取单菌落接种于5mL含卡那霉素的LB培养基，37℃，200rpm过夜培养，以1％的接种量接入50mLLB培养基中，37℃，200rpm继续培养2～3h；待培养物OD600＝0.6～0.8时，加入IPTG，使其终浓度为0.1mmol/L，16℃，200rpm过夜培养，6000rpm离心收集菌体，用0.85％的氯化钠溶液洗涤，用5mL无菌水重悬菌体，超声破碎，1...

【专利技术属性】
技术研发人员：高晓冬，李子杰，陈洲，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32