乙型肝炎疫苗制造技术

本发明专利技术提供一种乙型肝炎疫苗，其包含仅乙型肝炎病毒的L蛋白或其突变体在脂质膜上聚集而形成的表面抗原粒子。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】乙型肝炎疫苗
本专利技术涉及使用了HBs-L抗原的乙型肝炎疫苗。
技术介绍
乙型肝炎病毒(HBV)的表面抗原存在L抗原(由Pre-S1、Pre-S2及S区域形成)、M抗原(由Pre-S2及S区域形成)及S抗原(仅由S区域形成)这3种(这些抗原分别被称为HBs-L抗原、HBs-M抗原、HBs-S抗原)。乙型肝炎用的疫苗主要使用S抗原，一部分也使用了M抗原。在作为HBV的表面抗原发挥功能的蛋白质中，Pre-S1区域是HBV病毒识别人肝细胞并进行结合的传感器。因此，对Pre-S1区域的功能进行中和的抗体不仅有希望作为对乙型肝炎的预防疫苗，而且在阻止体内HBV病毒扩散的意义上，作为治疗疫苗也是很重要的。编码L蛋白的基因(称为L抗原基因)具有3个翻译起始位点和共同的终止密码子。因此，在使L抗原基因在CHO细胞等动物细胞中表达时，形成L、M及S这3种蛋白质。通过将这3种蛋白质提呈至一个脂质粒子，可形成混合有L、M及S蛋白的抗原粒子。在这样的情况下，已知有利用了3种抗原L抗原、M抗原及S抗原的混合物的疫苗(例如，作为市售的预防疫苗的Sci-B-VacTM(VBIVaccinesInc.以色列)。另外，也可以考虑将3种抗原的混合物作为乙型肝炎的治疗疫苗来利用(HBV疫苗及其制造方法：日本特表2010-516807)。然而，这些抗原是L抗原、M抗原及S抗原的混合物，尚不知晓仅利用L抗原的疫苗开发。另外，推测乙型肝炎病毒(HBV)持续性感染者世界上约有4亿人，日本的HBV感染率高达1.5％。在日本，HBV母婴感染预防、输血筛查、对高风险人群接种疫苗(选择性疫苗接种)等各种预防策起到效果，HBV感染者数量具有减少的倾向。另一方面，许多不是这些预防措施的对象的人对HBV没有免疫，处于对HBV没有防备的状态，因此，即使是现在，也会有一定数量的因水平初次传播导致的B型急性肝炎、暴发性肝炎的患者。为了预防水平传播，日本从今年开始进行对HBV的普遍疫苗接种。如上所述，HBV的病毒粒子表面存在HBs-L抗原、HBs-M抗原、HBs-S抗原这3种蛋白质(图1)。在日本，虽然使用2种HBV预防疫苗，但均使用了HBs-S抗原，而约10％的人对任一疫苗均未发现产生HBs抗体(HB疫苗无反应者)，无法在HBV疫苗接种中受益。因此，根除HBV水平传播需要HBV疫苗无反应者少的更强力的疫苗。另外，虽然尝试了使用HBs-S抗原对乙型肝炎的免疫治疗，但没有获得足够的治疗效果，要求更加强力的免疫治疗方法。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特表2010-516807号公报非专利文献非专利文献1：AverhoffF,etal.AmJPrevMed.1998；15:1-8.非专利文献2：HoriikeN,etal.HepatolRes.2002；23:38-47.
技术实现思路
专利技术要解决的课题从制造上的简便性出发，目前的疫苗使用了HBs-S抗原。但是，在吸附于肝细胞时，使用了L蛋白的N末端，希望诱导对该区域的抗体或细胞免疫。另外，如果在感染后病毒的活动性持续，则会由慢性肝炎发展为肝硬化、肝细胞癌、肝衰竭。现在，在乙型肝炎治疗中使用了PEG化IFN(聚乙二醇化干扰素)及作为核酸类似物的恩替卡韦。PEG化IFN具有免疫激活作用、抗病毒作用，在血清转换例中，虽然效率高且效果持续，但高频率且多种副作用是严重的问题。另外，恩替卡韦虽然通过抑制病毒的复制而使HBVDNA量减少，但其药效随给药中止而迅速消失，肝炎复发。由于这些问题，强烈希望开发与现有方法不同机理的新治疗方法。因此，本专利技术的目的在于提供一种对乙型肝炎的新型治疗疫苗。本专利技术人为了解决上述课题而进行了深入研究，结果是，通过对Beacle公司开发制造的HBs-L抗原(图2)进行免疫，尝试开发比现有疫苗显示出更强力的感染发病预防效果的疫苗，成功地通过使用HBs-L抗原解决了上述课题，从而完成了本专利技术。解决课题的方法即，本专利技术如下所述。(1)一种乙型肝炎疫苗，其包含仅乙型肝炎病毒的L蛋白或其突变体在脂质膜上聚集而形成的表面抗原粒子。(2)根据(1)或(2)所述的疫苗，其中，L蛋白或其突变体是以下的(a)或(b)蛋白质。(a)由序列号1所示的氨基酸序列构成的蛋白质(b)由在序列号1所示的氨基酸序列中第6位～第113位的Pre-S1区域内6个以下、第114位～第162位的Pre-S2区域内6个以下、第163位～第385位的S区域内13个以下、且总计为16个以下的氨基酸发生缺失或取代而得到的氨基酸序列构成的蛋白质(3)根据(1)或(2)所述的疫苗，其中，L蛋白或其突变体通过酵母表达。(4)根据(1)～(3)中任一项所述的疫苗，其通过对受试者给药而产生对L蛋白的Pre-S1和/或PreS2区域的抗体。(5)根据(1)～(4)中任一项所述的疫苗，其通过对受试者给药而诱导对L蛋白的Pre-S1和/或PreS2区域的细胞免疫。(6)根据(1)～(6)中任一项所述的疫苗，其还包含乙型肝炎病毒的核心蛋白。(7)根据(6)所述的疫苗，其通过对受试者给药而进一步诱导对核心蛋白的抗体。(8)根据(6)或(7)所述的疫苗，其通过对受试者给药而进一步诱导对核心蛋白的细胞免疫。(9)根据(1)～(8)中任一项所述的疫苗，其对乙型肝炎病毒的中和抗体效价至少为2～1000。(10)根据(1)～(9)中任一项所述的疫苗，其对乙型肝炎病毒与人肝细胞结合的抑制效果至少为50～100％。专利技术的效果根据本专利技术，可以提供乙型肝炎疫苗。通过本专利技术，首次可以对乙型肝炎病毒的中和抗体效价进行定量分析·提示，明确显示出其抗乙型肝炎病毒效果。附图说明图1是示出HBV的结构的图。图2是示出L抗原的图。图3是示出L抗原的银染色、以及利用对L抗原的S、Pre-S1及Pre-S2的抗体进行的蛋白质印迹法(westernblot)的图。图4是示出对树鼩的HBV抗原的免疫方法的图。图5是示出对兔的HBV抗原的免疫方法的图。图6是示出由抗HBs-L抗体的ELISA得到的检测结果的图。图7是示出由抗HBs-S抗体的ELISA得到的检测结果的图。图8是示出由兔抗体(HBs-S抗原、HBs-L抗原免疫)的ELISA得到的检测结果的图。图9是示出树鼩免疫血清的中和抗体效价的图。图10是示出抗HBs-L抗体及抗HBs-S抗体的HBV的肝细胞结合抑制活性的图。图11是示出纯化后的HbcAg的电泳结果的图。图12是示出小鼠抗体检测ELISA的结果的图。图13是示出通过给药HBs-L及HBc抗原进行的细胞免疫活性化试验的结果的图。具体实施方式在本说明书中，L蛋白是指构成L抗原的蛋白质，M蛋白是指构成M抗原的蛋白质，S蛋白是指构成S本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种乙型肝炎疫苗，其包含仅乙型肝炎病毒的L蛋白或其突变体在脂质膜上聚集而形成的表面抗原粒子。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170714 JP 2017-1380471.一种乙型肝炎疫苗，其包含仅乙型肝炎病毒的L蛋白或其突变体在脂质膜上聚集而形成的表面抗原粒子。


2.根据权利要求1或2所述的疫苗，其中，L蛋白或其突变体是以下的(a)或(b)蛋白质：
(a)由序列号1所示的氨基酸序列构成的蛋白质；
(b)由在序列号1所示的氨基酸序列中第6位～第113位的Pre-S1区域内6个以下、第114位～第162位的Pre-S2区域内6个以下、第163位～第385位的S区域内13个以下、且总计为16个以下的氨基酸发生缺失或取代而得到的氨基酸序列构成的蛋白质。


3.根据权利要求1或2所述的疫苗，其中，L蛋白或其突变体通过酵母表达。


4.根据权利要求1～3中任一项所述的疫苗，...

【专利技术属性】
技术研发人员：小原道法，真田崇弘，日浅阳一，小原恭子，乡保正，织田康则，
申请(专利权)人：公益财团法人东京都医学总合研究所，国立大学法人爱媛大学，国立大学法人鹿儿岛大学，比科尔公司，
类型：发明
国别省市：日本;JP