用于检测血浆中游离微卫星不稳定状态的组合物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了用于检测血浆中游离微卫星不稳定状态的组合物及其应用，综合检测单核苷酸重复位点BAT‑26、BAT‑25、NR‑21、NR‑24、NR‑27、Mono‑27，用于血浆CtDNA中MSI的检测，为了提高6个单核苷重复位点检测灵敏度，对其位点进行特殊的设计，对于blocker引物3’端的修饰进行体系筛选，最终确定ddC 3’端修饰，能够打破常规测序检测灵敏度低(灵敏度20％左右)的瓶颈，能够简单快速且检测灵敏度达到突变低于1％的检测方法，最终本发明专利技术对于MSI的检测不仅提高其在组织中的检测性能，同样依靠其超灵敏性应用到血浆CtDNA中MSI的检测。

Composition for detecting the unstable state of free microsatellite in plasma and its application

【技术实现步骤摘要】
用于检测血浆中游离微卫星不稳定状态的组合物及其应用
本专利技术属于基因检测的
，具体涉及一种用于检测血浆中游离微卫星不稳定状态的组合物及其应用。
技术介绍
目前，微卫星是由2～6个核苷酸的串联重复片段构成，由于重复单位的重复次数在个体间呈高度变异性并且数量丰富，因此微卫星标记应用广泛。在肿瘤细胞中，错配修复系统中相关基因(MismatchRepair,MMR)缺失时,可导致微卫星重复序列不稳定(微卫星突变)，导致其序列缩短或延长，从而引起微卫星不稳定(microsatelliteinstability,MSI)。根据MSI不稳定的程度，可分为微卫星高度不稳定(microsatelliteinstability-high,MSI-H)，微卫星低度不稳定(microsatelliteinstability-low,MSI-L)和微卫星稳定(microsatellitestable,MSS)型。结直肠癌(ColorectalCancer,CRC)发生的遗传因素包括染色体不稳定性(ChromosomeInstability,CIN)和微卫星不稳定性(MicrosatelliteInstability,MSI)。约80-85％的CRC由CIN引起，包括家族性腺瘤性息肉病(Familialadenomatouspolyposis,FAP)(APC基因胚系突变)和散发性CRC(APC、P53、DCC、KRAS等基因突变)；而另外15-20％的CRC则主要是由MSI引起，包括遗传性非息肉病性结直肠癌(HereditaryNonpolyposisColorectalCancer,HNPCC，又称Lynch综合征)(错配修复基因胚系突变)和散发性MSI(+)CRC(错配修复基因MLH1基因启动子甲基化)。MSI表现为同一微卫星位点在不同个体之间以及同一个体的正常组织与某些异常组织之间，微卫星位点的重复单位的数目不同。近年来的大量研究表明：MSI与肿瘤发生密切相关，如结直肠癌、胃癌、子宫内膜癌等。尤其是结直肠癌，临床上已将MSI作为结直肠癌预后和制定辅助治疗方案的重要分子标志物。据文献报道，大约15％的结直肠癌中存在MSI现象，与无MSI的结直肠癌相比，携带有MSI-H的II期结直肠癌患者预后较好，但从5-FU辅助化疗获益较少。Lynch综合征，亦称遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)，是由MMR基因胚系突变所致的显性遗传病。90％以上的Lynch综合征具有MSI特征，而散发性结直肠癌中只有约15％，所以临床上可用MSI检测来进行Lynch综合征的筛查。2015年在新英格兰医学杂志发表的NCT01876511研究结果表明，PD-1单抗治疗对MSI-H的mCRC表现出高缓解率，因此PEMBRO单抗治疗MSI-H的mCRC获得FDA突破性疗法认定。2016年ASCO年会上发布的CheckMate-142，Ⅱ期研究的数据表明，MSI-H的mCRC患者不仅可从PD-1免疫治疗获益，而且对PD-1和CTLA-4联合治疗的临床活性和生存期都远远超过了单独使用PD-1的疗效。2017年5月23日，美国FDA批准了默沙东公司的“明星”PD-1抗体pembrolizumab(商品名：Keytruda)用于治疗携带一种特定基因特征的任何一种实体瘤，具体来说，Keytruda被批准用于治疗携带“MSI-H/dMMR亚型”的成人和儿童实体瘤患者。1997年，NCI推荐使用BAT-26、BAT-25、D5S346、D2S123和D17S2505个位点检测肿瘤，若其中2个或2个以上位点有改变则为高频率MSI(MSI-H)，有1个位点改变则为低频率MSI(MSI-L)，没有改变则称为微卫星稳定(MSS)。在2002年NCI研讨会中，由于双核苷酸D5S346、D2S123和D17S250位点的灵敏度和特异性检测受限、均低于单核苷酸，修改了MSI检测指南，主要推荐使用更多的单核苷酸进行检测(在双核苷酸不稳定情况下)。本专利技术中选取检测MSI单核苷酸重复位点有BAT-26、BAT-25、NR-21、NR-24、NR-27、MONO-27，旨在增强整个MSI检测的特异性和灵敏度。目前MSI检测方法局限于组织检测，例如国内医院开展MSI多通过PCR法结合毛细管电泳法来检测MSI状态。该方法为目前的金标准检测。但目前市场上多数产品由于受一代测序技术限制，灵敏度只能达到20％左右。对于肿瘤体细胞突变而言，突变率检测应低至1％，因此，现有检测技术远远不能满足临床需求。对于组织样本而言，目前临床上很多肿瘤患者无法进行手术，很多穿刺患者依从性差，并且穿刺自身有一定的临床风险，亦或是某些肿瘤解剖位置不便进行穿刺，还有最重要的原因肿瘤组织具有异质性(即不同的肿瘤细胞表现不一)。基于上述原因，亟需寻求一种无创且灵敏度高的技术手段来对MSI状态进行检测。近年来，液态活检作为一种无创检测技术具有广泛的临床应用前景，可以通过采集血液来检测血浆中肿瘤游离DNA(CtDNA)的基因突变状态。肿瘤血液检测具有组织检测所不能具有的无创性、检测实时性以及无组织异质性等特征，具有显著的临床意义。但是血液中CtDNA的量极少，因此选择一种怎样的技术检测手段尤其重要。近来，基于二代测序的血浆CtDNA中MSI检测方法也有上市，但是其检测成本高，并且检测过程中的质控步骤多，操作过程复杂，对于最终结果的准确性难以预估，另外最后出来的结果需要专业的生物信息学人员进行解读，判读过程繁琐。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于检测血浆中游离微卫星不稳定状态的组合物及其应用，解决了常规测序检测灵敏度低的问题，避免了检测成本高、检测过程中质控步骤多、操作过程复杂和对于最终结果的准确性难以预估的缺陷。为了实现上述目的，本专利技术提供的一种用于检测血浆中游离微卫星不稳定状态的组合物，所述组合物由分别针对用于检测待检样品中与微卫星不稳定性相关的特异性目的基因的引物对组成，为：NR-21基因正向引物F(NR-21-F)：SEQIDNO.1：ATTTTTATATTTAAATGTATGTCTCC，NR-21基因反向引物R(NR-21-R)：SEQIDNO.2：CATTCACACTTTCTGGTCAC，NR-21基因blocker(NR-21-B)：SEQIDNO.3-ddC:CCCCTGGCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGCAACAC-ddC；NR-27基因正向引物F(NR-27-F)：SEQIDNO.4:AACCATGCTTGCAAACC，NR-27基因反向引物R(NR-27-R)：SEQIDNO.5:CTTGTCAAAATTCAGAATTTC；NR-27基因blocker(NR-27-B)：SEQIDNO.6-ddC:ACCACTGGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCCAC-ddC；MONO-27基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测血浆中游离微卫星不稳定状态的组合物，其特征在于，所述组合物由分别针对用于检测待检样品中与游离微卫星不稳定状态相关的特异性目的基因的引物对组成，为：/nNR-21基因正向引物F(NR-21-F)：SEQ ID NO.1，/nNR-21基因反向引物R(NR-21-R)：SEQ ID NO.2，/nNR-21基因blocker(NR-21-B)：SEQ ID NO.3-ddC；/nNR-27基因正向引物F(NR-27-F)：SEQ ID NO.4，/nNR-27基因反向引物R(NR-27-R)：SEQ ID NO.5；/nNR-27基因blocker(NR-27-B)：SEQ ID NO.6-ddC；/nMONO-27基因正向引物F(MONO-27-F)：SEQ ID NO.7，/nMONO-27基因反向引物R(MONO-27-R)：SEQ ID NO.8，/nMONO-27基因blocker(MONO-27-B)：SEQ ID NO.9-ddC；/nBAT-25基因正向引物F(BAT-25-F)：SEQ ID NO.10，/nBAT-25基因反向引物R(BAT-25-R)：SEQ ID NO.11，/nBAT-25基因blocker(BAT-25-B)：SEQ ID NO.12-ddC；/nBAT-26基因正向引物F(BAT-26-F)：SEQ ID NO.13，/nBAT-26基因反向引物R(BAT-26-R)：SEQ ID NO.14，/nBAT-26基因blocker(BAT-26-B)：SEQ ID NO.15-ddC；/nNR-24基因正向引物F(NR-24-F)：SEQ ID NO.16，/nNR-24基因反向引物R(NR-24-R)：SEQ ID NO.17，/nNR-24基因blocker(NR-24-B)：SEQ ID NO.18-ddC；/nPenta D基因正向引物F(Penta D-F)：SEQ ID NO.19，/nPenta D基因反向引物R(Penta D-R)：SEQ ID NO.20；/nPenta C基因正向引物F(Penta C-F)：SEQ ID NO.21，/nPenta C基因反向引物R(Penta C-R)：SEQ ID NO.22；/nAmel基因正向引物F(Amel-F)：SEQ ID NO.23，/nAmel基因反向引物R(Amel-R)：SEQ ID NO.24。/n...

【技术特征摘要】
1.一种用于检测血浆中游离微卫星不稳定状态的组合物，其特征在于，所述组合物由分别针对用于检测待检样品中与游离微卫星不稳定状态相关的特异性目的基因的引物对组成，为：
NR-21基因正向引物F(NR-21-F)：SEQIDNO.1，
NR-21基因反向引物R(NR-21-R)：SEQIDNO.2，
NR-21基因blocker(NR-21-B)：SEQIDNO.3-ddC；
NR-27基因正向引物F(NR-27-F)：SEQIDNO.4，
NR-27基因反向引物R(NR-27-R)：SEQIDNO.5；
NR-27基因blocker(NR-27-B)：SEQIDNO.6-ddC；
MONO-27基因正向引物F(MONO-27-F)：SEQIDNO.7，
MONO-27基因反向引物R(MONO-27-R)：SEQIDNO.8，
MONO-27基因blocker(MONO-27-B)：SEQIDNO.9-ddC；
BAT-25基因正向引物F(BAT-25-F)：SEQIDNO.10，
BAT-25基因反向引物R(BAT-25-R)：SEQIDNO.11，
BAT-25基因blocker(BAT-25-B)：SEQIDNO.12-ddC；
BAT-26基因正向引物F(BAT-26-F)：SEQIDNO.13，
BAT-26基因反向引物R(BAT-26-R)：SEQIDNO.14，
BAT-26基因blocker(BAT-26-B)：SEQIDNO.15-ddC；
NR-24基因正向引物F(NR-24-F)：SEQIDNO.16，
NR-24基因反向引物R(NR-24-R)：SEQIDNO.17，
NR-24基因blocker(NR-24-B)：SEQIDNO.18-ddC；
PentaD基因正向引物F(PentaD-F)：SEQIDNO.19，
PentaD基因反向引物R(PentaD-R)：SEQIDNO.20；
PentaC基因正向引物F(PentaC-F)：SEQIDNO.21，
PentaC基因反向引物R(PentaC-R)：SEQIDNO.22；
Amel基因正向引物F(Amel-F)：SEQIDNO.23，
Amel基因反向引物R(Amel-R)：SEQIDNO.24。


2.根据权利要求1所述的用于检测血浆中游离微卫星不稳定状态的组合物，其特征在于，对NR-21基因、NR-27基因、MONO-27基因和PentaD基因的正向引物的5’端进行FAM修饰；对BAT-25基因、BAT-26基因和PentaC基因的正向引物的5’端进行HEX修饰；对NR-24基因和Amel基因的正向引物的5’端进行TMR修饰；实现一管内多重多通道荧光位点的检测。


3.根据权利要求1所述的用于检测血浆中游离微卫星不稳定状态的组合物，其特征在于，进行一次检测时，NR-21-F(100μM)加入量0.01-0.03μL，NR-21-R(100μM)加入量0.01-0.03μL，NR-21-B(100μM)加入量0.1-0.3μL，NR-27-F(10...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘沛，王林海，杨磊，
申请(专利权)人：北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11