基因转运体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种基因转运体及其制备方法和应用。所述基因转运体包括纳米金属粒子和聚乙烯亚胺，所述基因转运体为核壳结构，其中，所述纳米金属粒子形成所述基因转运体的核心，所述聚乙烯亚胺包含有分子量为20000‑30000的第一聚乙烯亚胺和分子量为1500‑2000的第二聚乙烯亚胺，所述第一聚乙烯亚胺与第二聚乙烯亚胺交织包覆在所述核心的表面形成包覆外壳。该基因转运体通过静电吸附作用与插入外源目标基因片段的质粒结合后，能够突破胚胎细胞质膜外层的透明带屏障进入胚胎细胞，并促进胚胎细胞双链DNA断裂从而为外源目标基因片段的整合创造条件。同时，发明专利技术人还发现该基因转运体还具有粒径小、分散性好、稳定性高，毒性低等优势效果。

Gene transporter and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
基因转运体及其制备方法和应用
本专利技术涉及医药
，特别是涉及一种基因转运体及其制备方法和应用。
技术介绍
在生物学研究相关实验中，将特定的外源基因导入小鼠早期胚胎细胞内是一种重要的实验手段。目前使用的技术方法多种多样，却多少存在着一些缺点，如：所需仪器精密贵重、技术门槛高、对胚胎造成物理化学伤害、商品转染试剂不适用且价格昂贵等。另外，胚胎细胞本身还有着不同于体细胞之处，其细胞质膜外层有着一层透明带，双层的生物屏障致使外源基因进入胚胎细胞又多了一重困难。金属纳米材料，由于其独特的物理化学性质和较好的生物相容性而在基因治疗和生物学研究中有着广泛的应用。聚乙烯亚胺是转染效率较高的阳离子聚合物之一，其富含氨基，具有“质子海绵效应”，带正电荷的氨基基团能与DNA分子中带负电荷的磷酸基团通过静电吸附作用相互结合，从而使其具有较强的结合和压缩DNA的能力，所形成的复合物能被细胞内吞，并可以帮助DNA逃脱胞内溶酶体的吞噬，免受核酸酶降解，从而将外源基因输送到细胞核内并表达。传统上，采用纳米金属粒子与聚乙烯亚胺作为载体进行外源基因转染主要用于转染Hela细胞和KB细胞(一种人类口腔上皮癌的细胞株)等。例如：一种非病毒基因载体，由纳米金颗粒和阳离子聚合物以硫金键结合组成；该含纳米金颗粒的基因载体和基因物质的DNA复合形成复合物颗粒；其中阳离子聚合物是超支化聚乙烯亚胺或超支化聚乙烯亚胺与聚谷氨酸苄酯的共聚物。再例如：聚乙二醇化修饰的超支化聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒。然而，基于胚胎细胞的特异性，这些传统技术提供的载体并不适用胚胎细胞。
技术实现思路
基于此，本专利技术有必要提供一种适用于胚胎细胞的基因转运体，该基因转运体通过静电吸附作用与核酸结合后，能够突破胚胎细胞质膜外层的透明带屏障进入胚胎细胞。本专利技术的目的主要是通过一下技术方案实现的：一种基因转运体，所述基因转运体包括纳米金属粒子和聚乙烯亚胺，所述基因转运体为核壳结构，其中，所述纳米金属粒子形成所述基因转运体的核心，所述聚乙烯亚胺包含有分子量为20000-30000的第一聚乙烯亚胺和分子量为1500-2000的第二聚乙烯亚胺，所述第一聚乙烯亚胺与第二聚乙烯亚胺交织包覆在所述核心的表面形成包覆层。上述的基因转运体的制备方法，所述制备方法包括：向所述聚乙烯亚胺的溶液中加入纳米金属粒子溶液，搅拌。上述的基因转运体在制备治疗胚胎相关疾病的基因治疗药物中的应用。一种核酸/基因转运体复合物，包括上述的基因转运体以及核酸，所述基因转运体和所述核酸通过静电吸附作用结合，所述核酸包含有外源目标片段。上述的核酸/基因转运体复合物的制备方法，所述制备方法包括：将所述核酸的溶液和所述基因转运体的溶液混合。一种稳转胚胎细胞试剂盒，所述试剂盒包含有上述的基因转运体。一种稳转胚胎细胞的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：将待转胚胎细胞接种于添加上述的核酸/基因转运体复合物的培养基中，培养。与现有技术相比，本专利技术具备如下有益效果：本专利技术选用分子量为20000-30000第一聚乙烯亚胺和分子量为1500-2000的第二聚乙烯亚胺包裹于纳米金属粒子的表面从而形成基因转运体，该基因转运体通过静电吸附作用与核酸结合后，能够突破胚胎细胞质膜外层的透明带屏障进入胚胎细胞。并且该基因转运体还促进胚胎细胞双链DNA断裂从而为外源目标片段的整合创造条件。同时，专利技术人还发现该基因转运体还具有粒径小、分散性好、稳定性高，毒性低等优势效果。附图说明图1为实施例1AuNP-PEI溶液的颜色及紫外可见吸收光谱图；图2为实施例1AuNP-PEI的粒径分布及透射电镜下的形貌图；图3为实施例1不同质量比AuNP-PEI与DNA复合后凝胶电泳阻滞图；图中，1-6泳道对应的AuNP-PEI与DNA质量比分别为：0:1、0.1:1、0.2:1、0.3:1、0.4:1和0.5:1；图4为实施例1不同质量比AuNP-PEI与DNA稳定性测试结果图；图中，自左向右对应的AuNP-PEI与DNA质量比依次是0.5:1、1:1、2:1、4:1、5:1；图5为实施例1不同浓度AuNP-PEI对小鼠胚胎细胞的毒性图；图中，1：对照组，2：AuNP-PEI0.5μg/ml组，3：AuNP-PEI1μg/ml组，4：AuNP-PEI5μg/ml组，5：AuNP-PEI(转染6h后洗脱)5μg/ml组，6：AuNP-PEI10μg/ml组，7：AuNP-PEI15μg/ml组；图6为实施例1荧光显微镜下观察金纳米粒子基因载体的体外转染效果图；图7为实施例1荧光显微镜下观察体外转染细胞Tunel染色效果图；图8为实施例1荧光显微镜下观察到的体外转染细胞Cdx2和Oct4双染色效果图；图9为实施例1荧光显微镜下观察基因载体体外转染后细胞的免疫荧光图；图10为实施例1转染后移植小鼠的基因分型检测图；图11为实施例1转染后移植小鼠的组蛋白H2A.X抗体荧光染色图；图12为实施例1、实施例2、对比例1、对比例2的结果示意图；图13为本专利技术实施例基因转运体以及核酸/基因转运体复合物的自组装示意图；其中，10-纳米金属离子，20-聚乙烯亚胺，210-第一聚乙烯亚胺，220-第二聚乙烯亚胺，30-基因转运体，40-核酸，50-核酸/基因转运体复合物。具体实施方式为了便于理解本专利技术，下面将参照相关实施例对本专利技术进行更全面的描述。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。本专利技术实施例提供一种基因转运体，所述基因转运体包括纳米金属粒子和聚乙烯亚胺，所述基因转运体为核壳结构，其中，所述纳米金属粒子形成所述基因转运体的核心，所述聚乙烯亚胺包含有分子量为20000-30000的第一聚乙烯亚胺和分子量为1500-2000的聚第二乙烯亚胺，所述第一聚乙烯亚胺与第二聚乙烯亚胺交织包覆在所述核心的表面形成包覆外壳。优选地，所述第一聚乙烯亚胺和第二聚乙烯亚胺的质量比为1:1-2:3。优选地，所述纳米金属的质量与所述第一聚乙烯亚胺和第二聚乙烯亚胺的质量之和的比为1:1-2:1。优选地，所述纳米金属粒子为纳米金粒子。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基因转运体，其特征在于，所述基因转运体包括纳米金属粒子和聚乙烯亚胺，所述基因转运体为核壳结构，其中，所述纳米金属粒子形成所述基因转运体的核心，所述聚乙烯亚胺包含有分子量为20000-30000的第一聚乙烯亚胺和分子量为1500-2000的第二聚乙烯亚胺，所述第一聚乙烯亚胺与所述第二聚乙烯亚胺交织包覆在所述核心的表面形成包覆外壳。/n

【技术特征摘要】
1.一种基因转运体，其特征在于，所述基因转运体包括纳米金属粒子和聚乙烯亚胺，所述基因转运体为核壳结构，其中，所述纳米金属粒子形成所述基因转运体的核心，所述聚乙烯亚胺包含有分子量为20000-30000的第一聚乙烯亚胺和分子量为1500-2000的第二聚乙烯亚胺，所述第一聚乙烯亚胺与所述第二聚乙烯亚胺交织包覆在所述核心的表面形成包覆外壳。


2.根据权利要求1所述的基因转运体，其特征在于，所述第一聚乙烯亚胺和所述第二聚乙烯亚胺的质量比为1:1-3:2。


3.权利要求1或者2所述的基因转运体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：向所述聚乙烯亚胺的溶液中加入纳米金属粒子溶液，搅拌，在搅拌时所述聚乙烯亚胺与纳米金属粒子自组装形成具有所述核壳结构的基因转运体。


4.根据权利要求3所述的基因转运体的制备方法，其特征在于，所述聚乙烯亚胺溶液所含聚乙烯亚胺的质量百分含量和为0.01-1％，所述纳米金属粒子溶液所含纳米金属粒子的质量百分含量为1-3％；或/和，所述搅拌的温度为22-27℃，所述搅拌的转速为700-900rpm，所述搅拌的时间为45-50...

【专利技术属性】
技术研发人员：张迪，王旗，李文雍，王荣，程小翠，李欢欢，
申请(专利权)人：阜阳师范大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34