本发明专利技术公开了一类密码子优化的人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1编码基因，所述基因在被转入酵母细胞后可高效地表达重组人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1。本发明专利技术还公开了一种具有免疫原性的大分子，其主要由所述经密码子优化的人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1编码基因在酵母细胞中表达产生。本发明专利技术还公开了所述具有免疫原性的大分子的应用和组合物。
【技术实现步骤摘要】
重组人乳头瘤病毒蛋白表达本申请是申请日为2014年2月18日，申请号为201410054725.9，专利技术名称为“重组人乳头瘤病毒蛋白表达”的专利技术专利的分案申请。
本领域涉及分子生物学领域，具体而言，本专利技术涉及经密码子优化而适于在毕赤酵母中表达的各种人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1的基因，以及含有该人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1基因的载体，菌株，表达该基因的方法，及其用途。
技术介绍
人乳头状瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)是乳多空病毒科多瘤病毒亚科的一个无包膜的小型双链环状DNA病毒。HPV可通过人体间的密切接触传播，引起被感染者的皮肤出现寻常疣和肛门生殖器尖锐湿疣等病变，被列为性传播疾病。1995年，国际癌症研究中心公布的研究结果证实，HPV与宫颈癌有密切的因果关系。由此可见，HPV感染已成为严重危害人类健康的病原体。因此，研制高效、廉价的HPV疫苗，对于预防女性宫颈癌和HPV感染所引起的性传播疾病具有十分重要的意义。目前已经确定的HPV型超过100种。采用灵敏的检测方法，可以从几乎100％的宫颈癌患者病变组织中检测到高危HPV-DNA。根据HPV亚型与女性生殖道恶性肿瘤的关系，将HPV分为低危型和高危型。HPV6、11、34、40、42等型多见于良性宫颈病变如宫颈湿疣及宫颈上皮轻度不典型性增生病变中，属HPV低危型；而宫颈上皮重度不典型增生及宫颈癌中以HPV16、18、31、33、35、39、45，52，58型感染更为多见，这些亚型为高危型。不同人群中一系列的研究已证实生殖道的HPV16、18型感染与宫颈癌的发生高度相关，较其他危险因素更密切。宫颈癌患者中，约50-60％是由HPV16感染引起，HPV18约占14％，HPV45占约8％，HPV31占约5％，其余型占23％(WalboomersJM.etal.JPathol1999；189:12-19)。根据2010年世界卫生组织WHO的报告，HPV58是中国大陆地区宫颈癌中HPV检测率第3位的高危型别，发生率为11.7％，属于在中国发生率较高的HPV亚型(ChinaHumanPapillomavirusandRelatedCancers,FactSheet2010,WHO/ICOInformationCentreonHPVandCervicalCancer,Sep15,2010)。宫颈癌是仅次于乳腺癌的第二大妇科恶性肿瘤，全球每年有超过50万的妇女被诊断出患有宫颈癌，27万妇女死于此病，年龄标准化感染率达10.5％。早在80年代初，HaraldzurHausen就发现人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)的感染与宫颈癌发病有关，后续的大量研究也已证明HPV与宫颈癌及其癌前病变有密切联系。到目前为止，已发现了百余种HPV基因型，其中约40种可以感染生殖道粘膜。一个正常妇女一生中宫颈至少感染一种HPV的终生累计概率约为40％。国内目前尚无系统的尖锐湿疣和HPV相关调查，但是各地区的分别调查基本可以说明HPV6、11在尖锐湿疣中的重要作用。近期的深圳地区的流行病学调查结果显示HPV6、11型感染者在尖锐湿疣患者中约占80％(数据来源：深圳市人民医院352例尖锐湿疣患者生殖道人乳头状瘤病毒基因亚型的分布及意义，唐敏；戴勇；吕晓萍；李体远；第三军医大学学报,2007年21期)；临沂地区的调查结果HPV6、11型感染者在尖锐湿疣患者中占85.19％，(数据来源：108例尖锐湿疣患者HPV的基因分型及临床分析，熊瑛；社区医学杂志,2007年17期)。HPV是无包膜二十面体对称病毒，其病毒基因组DNA为闭合环状，长度约7200-8000bp，由早期编码区(earlyregion)、晚期编码区(lateregion)和位于两者之间的长调控区(longcontrolregion)组成。其中晚期编码区含两个开放阅读框(ORF)，编码病毒衣壳蛋白L1和L2。L1蛋白分子量约55kDa，为主要衣壳蛋白，以72个五聚体的形式支撑整个病毒衣壳结构，在不同型别中氨基酸序列高度保守，能够刺激机体产生保护性抗体。L2蛋白分子量较小，多位于L1蛋白内部。昆虫表达系统、酵母表达系统、原核表达系统和哺乳动物细胞等多种表达系统都可以通过单独表达主要衣壳蛋白L1或联合表达L1+L2的方式获得病毒样颗粒(VLP)。L1单独表达得到的VLP与天然病毒衣壳结构类似，可用于诱导与保护免受病毒侵袭有关的高效价病毒中和抗体应答。因此，鉴于L1蛋白于不同基因型别内部高度保守，并且能够单独表达形成VLP，以L1蛋白作为HPV疫苗研发的目标蛋白具有较高的可行性。不过，以表达重组病毒蛋白得到的VLP作为HPV疫苗的商业化开发与生产需要解决许多技术问题，其中首先需要解决的技术问题就是如何提高重组病毒蛋白的表达水平。而L1蛋白在大肠杆菌、毕赤酵母、杆状病毒等表达系统中，往往受到这些生物体内氨基酸密码子使用频率的限制导致表达水平较低甚至无表达。如Merck公司的美国专利No.7,498,036中记载，野生型VLP蛋白在酿酒酵母中的表达量为35μg/mg(破菌上清液中的VLP/破菌上清液总蛋白)左右。因此，本领域中需要一种高水平表达基因的方法，所述方法应该能够高水平地、操作简便和低成本地表达HPV基因。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，根据本专利技术的第一方面，提供了一种能够在毕赤酵母中表达的IIPV基因，所述基因具有SEQIDNO：6，SEQIDNO：7，SEQIDNO：8，SEQIDNO：9或SEQIDNO：10所示的核苷酸序列。利用毕赤酵母作为表达重组蛋白的表达系统，具有表达量高、操作简便、成本低等特点，并且相较于更高等的昆虫细胞与哺乳动物细胞而言更利于人规模工业化生产。由于不同物种间氨基酸密码子使用频率不一，在利用毕赤酵母表达重组蛋白的时候，往往根据目的蛋白的氨基酸序列经过密码子优化调整后得到更利于翻译的DNA序列。因此，本专利技术的经过密码子优化后的HPV基因在毕赤酵母中可以获得较高的表达水平，更有利于针对HPV的预防性疫苗的研发与生产。如本申请实施例所示，本专利技术的密码子优化过的HPV6，11，16，18，58基因在毕赤酵母中的表达量分别可最高达约134μg/mg，123μg/mg，135μg/mg，125μg/mg和132μg/mg(破菌上清液中的VLP/破菌上清液总蛋白)。根据本专利技术的第二方面，提供了一种在毕赤酵母中表达HPVL1基因的方法，包括下述步骤：(1)将本专利技术的HPVL1基因分别各自克隆入表达载体中；(2)将步骤(1)所得的表达载体转化至毕赤酵母菌株中；(3)使用抗生素对步骤(2)所得的转化菌株进行筛选，获得生长情况最好的一个或多个菌株；(4)通过测试各HPVL1基因的表达量对步骤(3)所得的菌株进行进一步筛选，获得表达量最高的一个或多个菌株；(5)使用步骤(4)所得的菌株进行表达，分别获得HPVL1蛋白。根据本专利技术的一个具体实施方案，所述步骤(1)中所述的表达本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种分离的基因，其编码人乳头瘤主要衣壳蛋白L1，其特征在于，所述的基因具有毕赤酵母偏爱的密码子，所述的基因具有SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQID NO: 9或SEQ ID NO: 10所示核苷酸序列。/n
【技术特征摘要】
1.一种分离的基因，其编码人乳头瘤主要衣壳蛋白L1，其特征在于，所述的基因具有毕赤酵母偏爱的密码子，所述的基因具有SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9或SEQIDNO:10所示核苷酸序列。
2.一种表达载体，所述的表达载体中含有权利要求1所述的基因的序列。
3.一种基因工程化的宿主细胞，所述的细胞含有权利要求2所述的表达载体，或其基因组中整合有权利要求1所述的基因。
4.如权利要求3所述的宿主细胞，其特征在于，所述的细胞是毕赤酵母细胞。
5.根据权利要求4所述的宿主细胞，其特征是，所述毕赤酵母选自毕赤酵母X-33、GS115、KM71和SMD1168菌株。
6.一种制备具有免疫原性的大分子的方法，该大分子的直径为50-80nm，主要由人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1自我装配而成，其特征在于，所述方法包括：
(1)培养权利要求3所述的宿主细胞，从而在宿主细胞内表达所述的人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1，并组装形成具有免疫原性的大分子；
(2)分离所述的具有免疫原性的大分子。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中包括：
(a)破碎步骤(1)获得的宿主细胞，获得含有具有免疫原性的大分子的上清液；和...
【专利技术属性】
技术研发人员：田平生，仝鑫，许丹，丛薇，刘瑞峰，张梦华，葛方昕，魏健，刘家骅，邬丹丽，曾宪放，王子龙，史力，
申请(专利权)人：上海泽润生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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