长链非编码RNA lncMGPF在调控猪肌肉发育功能中的应用制造技术

本发明专利技术属于动物基因工程技术领域，具体涉及长链非编码RNA lncMGPF在调控猪肌肉发育功能中的应用。本发明专利技术构建了长非编码RNA lncMGPF的超表达载体及干涉载体，通过慢病毒感染的方式在细胞水平感染猪骨骼肌卫星细胞并在活体水平感染猪的股二头肌，在多次感染病毒后采集猪的股二头肌，在猪个体上验证lncMGPF对肌肉生长发育的影响，为培育出更高产量的瘦肉猪新品种奠定技术基础。

Application of long-chain non coding RNA lncmgpf in the regulation of muscle development in pigs

【技术实现步骤摘要】
长链非编码RNAlncMGPF在调控猪肌肉发育功能中的应用
本专利技术属于动物基因工程
，具体涉及一个长链非编码RNAlncMGPF序列在促进猪骨骼肌卫星细胞分化及其在提高猪肌肉量的应用。
技术介绍
肌肉的生长发育是一个复杂的长期动态变化的过程，主要分为产前肌肉发育和产后的增长阶段。肌组织主要由肌纤维组成，大量的研究表明，动物的肌纤维数目在出生前已经确定，而肌肉量主要由肌纤维数目与大小决定。所以肌纤维的大小直接决定了肉类的产量，通过调控肌纤维的肥大来提高肉产量，是行之有效的方法和本领域研究的重点。从第一个lncRNAH19被识别以来，越来越多的lncRNA被发现在哺乳动物中，对其功能研究发现LncRNAs参与到多种生物学过程中，例如染色体失活，基因印记，染色体状态和基因组稳定性，干细胞的维持和多能性，细胞命运的决定，肌肉的生长发育癌症的发生和多种疾病控制等。目前在猪基因组中已经通过RNA-seq等技术识别了上万个lncRNAs，但在肌肉中的lncRNA的识别较少。Tang等(2017年)利用RNA-seq技术分析了贵州小型猪的lncRNA的表达，识别了10813个lncRNA，有57％的lncRNA表现出人和小鼠的保守性。此外，发现5455个lncRNA表现出高度的组织特异性。Ren等(2009年)利用LongSAGE构建猪lncRNA基因组文库发现TncRNA在猪胚胎其表达水平显著升高，在胚胎期90日龄的通城猪和长白猪胎儿骨骼肌中差异表达，这就表明其可能参与到猪胚胎期骨骼肌的发育(Renetal2009)。Zou等利用已有的猪转录组测序数据分析在猪的腿肌中识别了323个基因间lncRNA的表达。这些lncRNA相比mRNA具有更短的序列，更少的外显子和更低的表达水平，这些结果符合lncRNA的特性(Zouetal2017a)。进一步的分析发现这些lncRNA可能参与到肌肉收缩和肌肉发育过程。因此推测这些lncRNA可能和猪肌肉发育相关。ColinKern等(2018年)利用RNA-seq数据分析了不同物种肌肉特异表达lncRNA发现246个猪肌肉特异表达lncRNA，GO分析发现这些lncRNA和肌肉的发育显著相关(Kernetal2018)。Zhao等利用RNA-seq技术系统性地分析了猪不同时间骨骼肌中lncRNA的表达，识别了570个多外显子lncRNA，这些lncRNA表现出和mRNA类似的特征(Zhaoetal2015)。保守性分析发现一个在人，鼠和猪中高度保守的lncRNA，即CUFF.8631。该lncRNA在具有四个转录本，其中CUFF.8631.1和CUFF.8631.3随着肌肉的发育表现出显著的差异表达，暗示该转录本可能参与到肌肉生长发育过程中。最近的研究联合通过分析不同物种或者不同品种猪的转录组测序数据发现了大量的肌肉相关的lncRNA。Sun等在长白猪和蓝塘猪中利用Ribo-ZeroRNA-SeqandmiRNA-Seq技术整合分析了猪背最长肌中mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA转录组数据，发现了547个差异表达mRNA，5566个差异表达lncRNA和4360个差异表达circRNA。通过预测发现有19个lncRNA可能和miRNA结合发挥miRNA分子海绵的作用(Sunetal2017)。Zou等在约克夏猪和皖南花猪两个品种中利用转录组数据分析发现了352个与肌肉生长和肉质性状相关联的lncRNA(Zouetal2017b)。种种研究表明，长链非编码RNA在畜禽肌肉发育过程中存在重要作用，对畜牧业肉量生产具有重大的经济利用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，筛选一个长链非编码RNAlncMGPF，以调控猪骨骼肌卫星细胞的分化，进而提高猪肌肉量的生产量。本专利技术的其中一个目的是在猪上克隆一个新的长链非编码RNA片段，申请人将该片段命名为lncMGPF。本专利技术目的之二是验证lncMGPF片段调控猪骨骼肌卫星细胞分化中的功能验证。进一步地，利用利用本专利技术的lncMGPF片段提高猪肌肉产量的应用。本专利技术的技术方案如下：一个长链非编码(LongnoncodingRNAs,lncRNA)的RNAlncMGPF在促进猪骨骼肌卫星细胞分化，进而提高猪肌肉产量中的应用，所述的应用包括如下步骤：(1)取1日龄仔猪肌肉组织，用胶原酶I消化，利用差速贴壁法纯化分离骨骼肌卫星细胞；(2)以猪骨骼肌卫星细胞cDNA为模板，利用RACE方法获得lncMGPF的全长，该lncMGPF的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。(3)将步骤(2)所述的序列构建到一种慢病毒载体上，得到病毒载体PCDH-CMV-copGFP上。(4)利用步骤(3)所得的慢病毒载体PCDH-CMV-copGFP感染猪骨骼肌卫星细胞并诱导所述细胞分化，利用RT-qPCR，Westernblotting以及免疫荧光方法检测分化相关标志基因在mRNA和蛋白水平上的表达量。(5)将所得的慢病毒载体PCDH-CMV-copGFP注射到1月龄猪(例如大白猪，实施本本专利技术不限于该品种)的股二头肌中，每隔七天注射一次，连续注射四次后，采集猪的股二头肌肌肉样品，利用HE染色与组织免疫荧光染色对所述样品的肌纤维横截面积进行检测；(6)提取肌肉组织的RNA和蛋白，利用RT-qPCR和WersternBlot方法在RNA和蛋白水平上检测采集的肌肉样品中成肌分化相关的标志基因的表达水平的变化。本专利技术的有益效果是：(1)超表达lncMGPF后可以促进畜禽的肌肉产量，提高畜牧业生产效益，创造更多价值。(2)本专利技术所使用的方法相较传统转基因猪品种培育来说，具有周期短，见效快，成本低，为在大动物上研究基因的生物学功能提供了新的技术方案。(3)针对现今畜牧业生产上难以提高畜禽产肉量的现状，本专利技术可提供新的改良方法与手段。附图说明图1：本专利技术克隆的lncRNAlncMGPF的核苷酸序列(直观图)。图2：本专利技术中利用RACE技术研究lncMGPF全长序列电泳结果。图3：本专利技术中超表达lncMGPF后RT-qPCR检测成肌分化标志基因在RNA水平表达情况。以β-actin基因作为内参。图4：本专利技术中超表达lncMGPF后WB检测成肌分化标志基因在蛋白水平上的表达情况，和显示各蛋白经β-actin内参校正后的相对表达量。附图标记说明：图4中的A图是本专利技术中超表达lncMGPF后WB检测成肌分化标志基因在蛋白水平上的表达情况；图4中的B图显示各蛋白经β-actin内参校正后的相对表达量。图5：是本专利技术中超表达lncMGPF后检测MyoG、MyHC的免疫荧光结果。附图标记说明：图5中的A图为MyoG免疫荧光图，图5中的B图为MyoG免疫荧光量化图；图5中的C图为MyHC免疫荧光图，图5中的D图为MyHC免疫荧光量化图。图6：本专利技术中干涉lncMGPF后，RT-qPC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一个长链非编码的RNA lncMGPF在促进猪骨骼肌卫星细胞分化中的应用,其特征在于所述的应用包括如下步骤：/n(1)取1日龄仔猪肌肉组织，用胶原酶I消化，利用差速贴壁法纯化分离得到骨骼肌卫星细胞；/n(2)以所得的猪骨骼肌卫星细胞cDNA为模板，利用RACE方法获得lncMGPF的全长，该lncMGPF的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；/n(3)将步骤(2)所述的序列构建到一种慢病毒载体上，针对该序列设计siRNA，分别得到病毒载体LV-lncMGPF和载体LV-si-lncMGPF；/n(4)利用步骤(3)所得的慢病毒载体LV-lncMGPF和LV-si-lncMGPF感染猪骨骼肌卫星细胞，诱导所述的细胞分化，利用RT-qPCR，Western blotting以及免疫荧光方法检测分化相关标志基因在mRNA和蛋白水平上的表达量；/n(5)将所得的慢病毒载体LV-lncMGPF注射到1月龄猪的股二头肌中，每隔七天注射一次，连续注射四次后，采集猪的股二头肌肌肉样品，利用HE染色和组织免疫荧光染色对所述样品的肌纤维横截面积进行检测；/n(6)提取肌肉组织的RNA和蛋白，利用RT-qPCR和Werstern Blot方法在RNA和蛋白水平上检测采集的肌肉样品中成肌分化相关的标志基因的表达水平的变化。/n...

【技术特征摘要】
1.一个长链非编码的RNAlncMGPF在促进猪骨骼肌卫星细胞分化中的应用,其特征在于所述的应用包括如下步骤：
(1)取1日龄仔猪肌肉组织，用胶原酶I消化，利用差速贴壁法纯化分离得到骨骼肌卫星细胞；
(2)以所得的猪骨骼肌卫星细胞cDNA为模板，利用RACE方法获得lncMGPF的全长，该lncMGPF的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；
(3)将步骤(2)所述的序列构建到一种慢病毒载体上，针对该序列设计siRNA，分别得到病毒载体LV-lncMGPF和载体LV-si-lncMGPF；
(4)利用步骤(3)所得的慢病毒载体LV-lncM...

【专利技术属性】
技术研发人员：左波，吕威，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42