本发明专利技术公开了一种特异抑制人蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)靶基因表达的siRNA序列及其用途。所述siRNA可化学合成，也可根据其序列构建成相应的重组慢病毒或腺相关病毒等。上述siRNA或病毒转染人肝癌细胞HepG2及人正常肝细胞LO2后可有效抑制PCSK9表达，增加低密度脂蛋白受体(LDLR)蛋白水平，显著增强肝细胞摄取低密度脂蛋白(LDL)的活性。重组慢病毒高压尾静脉注射给药后可显著降低高胆固醇血症模型小鼠血浆总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL‑C)水平。上述siRNA或其重组病毒或其修饰物可用于预防和/或治疗高血脂症、动脉粥样硬化、心脑血管疾病、肥胖、糖尿病及肾病等病症。
【技术实现步骤摘要】
抑制人PCSK9基因表达的siRNA及其应用
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种抑制人蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)基因表达的siRNA及其在制备治疗PCSK9介导的相关疾病如高血脂症、动脉粥样硬化、心脑血管疾病、肥胖、糖尿病、肾病等病症药物中的应用。
技术介绍
高胆固醇血症可分为家族性和非家族性，临床表现为高血浆低密度脂蛋白胆固醇水平(lowdensitylipoproteincholesterol，LDL-C)，是心血管类疾病发生的重要因素。目前临床上广泛应用的降血脂药物以他汀类为主，但相当一部分患者会对其产生耐受(Eckel(2010)JClinEndocrinolMetab95:2015-22)，接受他汀类药物治疗后无法使LDL-C水平降低至期望值(Toutouzasetal.(2010)ExpertOpinPharmacother11:1659-72)，因此研制新型降脂药物具有重要的临床应用价值。PCSK9是由肝脏合成与分泌的蛋白酶，在胆固醇代谢中具有重要作用，可影响肝脏低密度脂蛋白受体(lowdensitylipoproteinrecepter，LDLR)水平(Fitzgeraldetal.(2014)TheLancet383:60-68)。PCSK9分泌进入血液循环后可与肝细胞表面LDL-R的表皮生长因子样结构域特异性结合，介导其进入肝细胞到达溶酶体，使LDL-R在溶酶体中降解，从而导致肝细胞表面LDL-R减少，进而降低肝脏结合和清除LDL-C的能力，最终导致血液中LDL-C水平升高(Zhangetal.(2008)ProcNatlAcadSciUSA105:13045-50)。因此，可通过抑制PCSK9治疗高胆固醇血症(Norataetal.(2014)AnnuRevPharmacolToxicol54:273-93)。此外，PCSK9表达升高与肥胖及2型糖尿病密切相关(Levensonetal.(2017)PediatrDiabetes18:755-60；Yangetal.(2016)DiabetesMetabResRev32:193-9)，也与肾病综合症及蛋白尿等慢性肾病(Pavlakouetal.(2017)IntUrolNephrol49:1015-24)，因此，抑制PCSK9表达可成为预防和治疗这些相关性疾病的重要途径。RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术于1998年由Fire等(Fireetal.(1998)Nature391:806-11)首次发现，随后迅速获得广泛应用。研究表明，在不同生物中均存在RNA干扰现象(Wilsonetal.(2013)AnnuRevBiophys42:217-39)。RNA干扰中引起基因沉默的双链RNA为siRNA，一般由一段长约21-23个核苷酸的双链RNA组成,其序列中包括与靶mRNA配对的正义链和反义链，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应(Singhetal.(2018)ArtifCellsNanomedBiotechnol46:274-83)。虽然siRNA能特异性抑制靶基因表达，但细胞内的siRNA很容易降解，难以实现稳定的基因沉默。慢病毒载体在细胞内感染效率高，免疫原型低，既能干扰分裂期的细胞又能感染非分裂期的细胞，且其介导的RNAi能在各种动物细胞内长期稳定地表达siRNA，抑制靶基因表达，因此具有高效、稳定、特异性强、适用范围广的特点。目前已有多种RNAi药物处于研发阶段或已获批上市，并显示出很好的治疗效果。例如，2018年8月10日，美国食品和药物管理局(FDA)批准了第一个siRNA药物ONPATTRO(patisiran)，用于治疗多发性神经病变的遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性(hATTR)(Settenetal.(2019)NatRevDrugDiscov18:421-46)。Alnylam公司的ALN-PC可抑制PCSK9的转录，且已进入I期临床试验(DellaBadiaetal.(2016)PharmacolTher164:183-94)。因此，利用RNAi抑制特定疾病靶基因表达已成为一种有效的疾病治疗途径。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种有效抑制人PCSK9基因表达的siRNA。本专利技术的第二个目的在于提供一种由上述siRNA序列构建而成的重组病毒表达载体。本专利技术的第三个目的在于提供上述siRNA、siRNA修饰物及重组病毒在制备高血脂症、动脉粥样硬化、心脑血管疾病、糖尿病等与PCSK9相关病症药物中的应用。为实现上述第一个目的，本专利技术的技术方案如下：采用生物信息学方法从Genebank获取人、金黄地鼠及猴的PCSK9mRNA序列(RefSeqID编号依次为NM_174936.3、XM_013114871.1和NM_001112660.1)，用DNAman(V6)软件寻找mRNA保守区序列。采用RNAstructure分析软件对PCSK9mRNA序列的二级结构进行预测，依据siRNA设计原则，综合分析其GC含量、mRNA作用位点的二级结构、siRNA对碱基偏爱性的要求等。在siRNA在线设计软件DSIR设计基础上，进一步寻找合适的siRNA靶序列，初步筛选出3对siRNA序列。再用NCBIGeneBank提供的BLAST软件，选择转录本参考序列数据库(TranscriptReferenceSequences)，对上述siRNA序列进行同源分析，排除siRNA非特异性抑制PCSK9以外其它基因的可能。初步筛选出的3对siRNA由上海吉玛制药技术有限公司合成，再通过体外细胞实验筛选出能有效抑制PCSK9基因表达的siRNA即si1318，所述siRNA序列为：正义链：5’-GGGACGAUGCCUGCCUCUAdTdT-3’(SEQIDNO:3)反义链：5’-UAGAGGCAGGCAUCGUCCCdTdT-3’(SEQIDNO:4)所述的抑制PCSK9基因表达的siRNA序列3’端垂悬有dTdT。为实现上述第二个目的，本专利技术采取的技术方案是：根据筛选的si1318序列，设计对应的带有环状结构的shDNA序列(SEQIDNO:7和SEQIDNO:8)，shDNA序列框架中的loop结构选用TTCAAGAGA，shDNA的转录终止序列采用TTTTTT结构。正义链模板的5’端添加了GATCC，反义链模板的5’端添加了AATTC，分别与BamHI和EcoRI酶切后形成的粘端互补。所述DNA分子序列为：正义链：5’GATCCGGGACGATGCCTGCCTCTATTCAAGAGATAGAGGCAGGCATCGTCCCTTTTTTG3’(SEQIDNO:7)反义链：5’AATTCAAAAAAGGGACGATGCCTGCCTCTATCTCTTGAATAGAGGCAGGCATCGTCCCG3’(SEQIDNO:8)在此基础上，将上述序列插入慢病毒表达载体pLVX-shRNA2(Clon本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种抑制人PCSK9靶基因表达的siRNA，其特征在于，所述RNA序列如下：/n正义链：5’-GGGACGAUGCCUGCCUCUA-3’，即SEQ ID NO:3；/n反义链：5’-UAGAGGCAGGCAUCGUCCC-3’，即SEQ ID NO:4。/n
【技术特征摘要】
1.一种抑制人PCSK9靶基因表达的siRNA，其特征在于，所述RNA序列如下：
正义链：5’-GGGACGAUGCCUGCCUCUA-3’，即SEQIDNO:3；
反义链：5’-UAGAGGCAGGCAUCGUCCC-3’，即SEQIDNO:4。
2.根据权利要求1所述的抑制人PCSK9靶基因表达的siRNA，其特征在于，所述序列3’端垂悬有dTdT。
3.一种编码抑制人PCSK9基因表达的shRNA的DNA序列，其特征在于，所述DNA序列的正义链如SEQIDNO:7所示，反义链如SEQIDNO:8所示。
【专利技术属性】
技术研发人员：谭树华，王维，陈佳利，陈雪梅，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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