植物花药花粉发育后期特异性表达启动子及其应用制造技术

本发明专利技术公开植物花药花粉发育后期特异性表达启动子

【技术实现步骤摘要】
植物花药花粉发育后期特异性表达启动子及其应用
本专利技术属于植物生物技术种领域，具体而言，本专利技术涉及分离的DNA，其能够指导可操作地连接在其下游的核酸在植物花药花粉中特异转录和/或表达。另外，本专利技术还涉及包含该DNA的表达盒和植物等，并涉及该DNA的应用。
技术介绍
植物基因调控主要是在转录水平上进行的，受多种顺式作用元件和反式作用因子的相互协调。启动子是重要的顺式作用元件，它是位于结构基因5’端上游区域调控基因转录的一段DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地结合，确保转录精确而有效地起始，在转录调控中起关键作用。根据其驱动基因表达的不同特点，启动子分为组成型启动子和特异性启动子：组成型启动子能在所有细胞或组织中，不分时间和空间地启动转录；特异性启动子又可分为组织特异性启动子和诱导型启动子，其中组织特异性启动子可启动下游基因在某些特定的器官或组织部位表达；而诱导型启动子平时不启动转录或转录活性很低，但在某些特定的逆境信号的刺激下，转录活性能够显著地提高。外源DNA序列可以通过连接到特定的启动子从而启动其在植物宿主中的表达，启动子类型的选择决定基因的表达时间和部位。目前在农业生物
广泛应用的主要是一些组成型的强启动子，比如花椰菜花叶病毒的CaMV35S启动子和玉米的Ubiquitin-1启动子，然而在利用这些启动子诱导目的基因转化水稻等作物以期改良作物的品质时，往往会由于目的基因表达的时间(发育阶段特异性)或空间(组织器官特异性)不能很好地控制而导致改良效果不明显，或者由于这些组成型启动子诱导基因表达量太高而对植物的生长发育造成影响，这些都是目前利用组成型强启动子结合功能基因来改良作物品质时遇到的障碍。此外，在研究某些代谢过程或调节途径时，常常需要将同一途径上的两个以上基因转化到同一个株系中去，如果采用转化其中一个基因得到转基因植株后再转化另外一个基因，或者两个基因分别转化完成后再进行杂交，都需要等待较长的时间。为了提高效率以缩短多个基因转化的时间，最近有报道可以利用新的载体同时进行多个基因的转化，但是在多基因转化时如果重复使用同一个启动子，也会由于启动子序列的高同源性可能导致基因沉默。近年来，通过基因工程调控植物花粉育性、创造植物雄性不育系及其恢复系已在一些作物上获得成功，为作物杂种优势的利用开创了新的前景。目前利用基因工程创造雄性不育的策略主要是利用花粉发育的特异启动子与外源基因嵌合，构建表达载体，转化植物来阻断花粉发育的过程从而达到雄性不育的目的。如在水稻中利用花粉发育后期特异性表达启动子PG47、造粉体转运信号肽基因BT1(TP)和α-淀粉酶基因ZM-AA1可构建花粉败育系统，造成转基因花粉不育(ChangZhenyi,ChenZhufen,WangNa,etal.(2016)Constructionofamalesterilitysystemforhybridricebreedingandseedproductionusinganuclearmalesterilitygene.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica113,14145-14150)。其中PG47启动子可驱动α-淀粉酶基因ZM-AA1在晚期花粉中表达，信号肽BT1(TP)可引导α-淀粉酶ZM-AA1蛋白进入到造粉体中，α-淀粉酶ZM-AA1蛋白可水解淀粉，任意关键调控元件出现问题都无法导致转基因花粉败育。植物花粉或花药启动子的驱动活性和特异性决定了通过基因工程手段调控花粉育性、创造植物不育系及恢复系的成败。目前已知的驱动活性高且特异性良好的植物花粉或花药特异启动子还相对较少，因此，对重要农作物——水稻的花粉特异表达启动子的克隆和功能分析对于在水稻中利用基因工程调控花粉育性、创造植物雄性不育系，从而为水稻杂种优势资源在水稻育种中的充分利用打下基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了2个植物花药花粉发育后期特异表达的启动子并应用上述启动子以控制花粉育性的方法。专利技术人通过RNA-Seq测序，在水稻中发现2个在晚期花粉(Stage11-12)中特异性高表达基因OsLSP(Latestagepollen-specific)，分别命名为OsLSP5和OsLSP6。具体地，分别取野生型水稻日本晴植株的根、茎、叶、外稃、內稃、雌蕊、花药(Stage6-12)和胚乳(DAP7和DAP25)，提取RNA，反转录为cDNA作为模板，以水稻ACTIN基因作为内参照，利用QuantitativeRealtime-PCR(qRT-PCR)方法，分析OsLSP5和OsLSP6基因在水稻各个组织中的表达情况。通过qRT-PCR基因表达量检测分析发现OsLSP5和OsLSP6基因只在花药发育后期(Stage11-12)特异性高表达，在根、茎、叶或同时期的其它花器官等组织器官中表达量较低或几乎不表达(如图1所示)。这表明，OsLSP5和OsLSP6基因是花药特异性表达的，且只在花药发育后期(Stage11-12)中特异性高表达。同时，结合花粉RNA-Seq结果，表明OsLSP5和OsLSP6基因是在花药花粉发育后期特异性表达的。本专利技术提供花药花粉发育后期特异性表达基因OsLSP5和OsLSP6的启动子，分别命名为pOsLSP5和pOsLSP6。所述启动子为花药花粉特异性表达启动子，即具有驱动基因在花药花粉发育后期中特异表达的功能。pOsLSP5启动子为自翻译起始位点ATG往上-2335bp的片段序列，如SEQIDNO:1所示；pOsLSP6启动子为自翻译起始位点ATG往上-1999bp的片段序列，如SEQIDNO:2所示。本专利技术所提供的植物花药花粉特异表达启动子，含有如SEQIDNO:1或2所示的核苷酸序列，或与SEQIDNO:1或2所示序列互补的DNA分子，或包含与SEQIDNO:1或2中所列核苷酸序列具有90％以上相似性的核苷酸序列，或包含来源于SEQIDNO:1或2序列上的100个及100以上连续的核苷酸片段，并且可以驱动与该启动子操作性连接的核苷酸序列在植物花药花粉中的特异性表达。本领域技术人员根据相同目的能够容易地鉴定并利用与上述2个植物花粉花药特异性启动子核苷酸序列互补的DNA分子，因此，具有启动子活性并在严格条件下与本专利技术启动子序列或其片段杂交的分离序列包括在本专利技术中。含有上述序列的表达载体、转基因细胞系以及宿主菌等均属于本专利技术的保护范围。扩增本专利技术所公开的SEQIDNO:1或2启动子的任一核苷酸片段的引物对也在本专利技术的保护范围之内。本专利技术所提供的启动子核苷酸序列还可用于从水稻以外的其它植物中分离相应序列，尤其是从其它单子叶植物中进行同源克隆。根据这些相应序列与本文所列启动子序列间的序列同源性，或与本启动子基因的同源性，使用如PCR、杂交等技术来鉴别分离这些相应序列。因此，根据它们与本专利技术所列的SEQIDNO:1或2启动子序列(或其片段)间的序列相似性而分离的相应片段，也包括在实施方案中。本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种花药花粉发育后期特异性表达启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列选自下列组的序列之一：/n（a）具有SEQ ID NO：1或2所示的序列；/n（b）在严格条件下能够与（a）所述序列的DNA杂交的DNA序列；/n（c）包含SEQ ID NO：1或2中至少100个连续核苷酸的DNA序列；和/n（d）与（a）-（c）之任一所述序列互补的DNA序列，/n所述花药花粉发育后期特异性表达启动子能够驱动目标基因在植物花药花粉发育后期组织中特异性表达。/n

【技术特征摘要】
1.一种花药花粉发育后期特异性表达启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列选自下列组的序列之一：
（a）具有SEQIDNO：1或2所示的序列；
（b）在严格条件下能够与（a）所述序列的DNA杂交的DNA序列；
（c）包含SEQIDNO：1或2中至少100个连续核苷酸的DNA序列；和
（d）与（a）-（c）之任一所述序列互补的DNA序列，
所述花药花粉发育后期特异性表达启动子能够驱动目标基因在植物花药花粉发育后期组织中特异性表达。


2.一种表达盒或重组表达载体，其特征在于，所述表达盒或重组表达载体包含权利要求1中所述的花药花粉发育后期特异性表达启动子，并且上述启动子在有效连接的调控序列调控下表达。


3.根据权利要求2所述表达盒或重组表达载体，其特征在于，所述调控序列含造粉体蛋白转导肽和α-淀粉酶基因。


4.根据权利要求2所述表达盒或重组表达载体，其特征在于，所述的含造粉体蛋白转导肽为BT1(TP)信号肽基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；所述的α-淀粉酶基因为ZM-AA1，其核苷酸序列如SEQIDNO：4所示。


5.一种权...

【专利技术属性】
技术研发人员：王梦龙，唐晓艳，
申请(专利权)人：深圳市作物分子设计育种研究院，深圳广三系农业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44