一种黄曲霉毒素降解菌的高效发酵方法技术

本发明专利技术公开了一种黄曲霉毒素降解菌的高效发酵方法，属于生物技术领域，包括种子液制备、发酵培养、添加携氧剂、测定黄曲霉毒素含量等步骤；利用本发明专利技术提供的在黄曲霉毒素降解菌的发酵体系中添加十二烷作为携氧剂的方法，能够提高目标菌种发酵效率，得到的目标菌种的发酵产物能显著的降低黄曲霉毒素的残留率，发酵20h的上清液降解黄曲霉毒素后的毒素残留率相比不加携氧剂的空白对照组降低了24.41％，毒素残留率仅为9.6％。

【技术实现步骤摘要】
一种黄曲霉毒素降解菌的高效发酵方法
本专利技术属于(涉及)微生物
，特别涉及到一种添加携氧剂的黄曲霉毒素降解菌的高效发酵方法。
技术介绍
黄曲霉毒素(aflatoxins)是一类含有二氢呋喃环结构的次级代谢产物，是一类毒性极强的天然毒素。其产生主要是由黄曲霉(Aspergillusflavus)和寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)等在一定的环境条件下生物合成的。黄曲霉毒素对人类有强毒性和高致癌性，广泛的分布在霉变的谷物及坚果(包括大米、玉米、花生、棉籽等)、被污染的乳及乳制品中。目前已发现的黄曲霉毒素共有18种，其中最常见的黄曲霉毒素主要是黄曲霉毒素B1、B2、G1及G2，其中，黄曲霉毒素B1是目前已知的含量最多、致癌效率最高的天然致癌物质。国际癌症研究机构(IARC)将黄曲霉毒素列为一类致癌物。黄曲霉毒素具有较强的耐热性，其中黄曲霉毒素B1的分解温度为268℃，而黄曲霉毒素被加热到280℃才开始被裂解破坏，在食品加工过程中含量几乎不会减少，所以黄曲霉毒素能被保留在整条食物链中而不会被普通加工流程除去。因此，被污染的农产品等食品生产原料内聚集的黄曲霉毒素是人类极大的健康威胁。如何去除黄曲霉毒素一直是一个棘手的问题，目前常规的手段有物理去除法、化学去除法和生物去除法。这些方法在实验室环境下都有较好的效果，但在应用中都因为成本、方法特性等原因不能广泛的应用，存在一定的局限性。目前生物酶解法是黄曲霉毒素降解的最新研究方向，采用培养菌株提取活性物质来分解黄曲霉毒素摆脱了以往传统方法的限制，有着大规模生产成本低、解毒物质几乎无毒性、且应用限制小，是化学和物理降解黄曲霉毒素方法的有竞争性的替代，具有良好的应用前景和研究价值。阿耶波多氏芽孢杆菌(Bacillusaryabhattai)DT也是这样一种能分解黄曲霉毒素的菌株。该菌种是从杭州(E120°12’，N30°16’)地区的园地、垃圾焚烧站等地收集的植物样品中分离筛选出的，对黄曲霉毒素有降解作用的一种野生菌，目前研究该菌种在LB培养基内37℃、摇床上180rpm培养24h的发酵上清液取900μL与100μL、浓度为20μg/mL的黄曲霉毒素甲醇溶液在37℃避光消解72h，黄曲霉毒素的降解率可达78％。对于需氧微生物来说，发酵体系内的溶氧水平是微生物生长繁殖的限制性底物。氧气在水中的溶解度较差，因此采用多种方法增大氧气在水中的溶解度，改善供氧条件能很好的提高菌种生长速率，达到提高胞内外产物产量的目的。传统的增加通气量的方式包括增大搅拌速率、增大通气量等，但这些方式无疑都会增大能源消耗，在实际生产应用中会增加生产成本。氧气在水中的溶解度较差，但在一些碳氢化合物和碳氟化合物中溶解度较好，例如正十六烷、十二烷、全氟化碳等。通过向培养液中添加一定量的碳氢化合物并通过摇床摇动等方法使这些碳氢化合物在气-液分界面来回穿梭能提高菌种的供氧量，加快菌的生长速度，提高胞内外物质产量。AdamW.Westbrook等人研究了氧载体在工程枯草芽孢杆菌异源产生HA中的应用。初步筛选的七种潜在氧载体中，其中在含有正庚烷、正十六烷、全氟甲基萘烷和全氟-1,3-二甲基环己烷的培养物中观察到HA滴度和/或细胞密度的显著改善。对载体浓度、载体添加时间和搅拌速率进行进一步调整，导致培养结果进一步改善，在仅培养10小时后HA滴度就达到4.5g/L。王爽等人使用6％的二甲基硅油、大豆油、橄榄油及表面活性剂吐温-80分别作为携氧剂添加到发酵初期的纳他霉素发酵液中，使纳他霉素的产量提高了50％以上，添加表面活性剂吐温-80使产量提高了82％。因此，探究黄曲霉毒素降解菌对氧气的依赖情况，通过改善供氧条件以达到提高菌种发酵效率，最终增强黄曲霉毒素降解能力就成为了可能。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种黄曲霉毒素降解菌的高效发酵方法。本专利技术是通过以下技术方案实现的：(1)种子液制备：将待用的黄曲霉毒素降解菌DT接种到细菌基础(LB)培养基中培养得到种子液；(2)发酵培养：将步骤(1)所述种子液接种到细菌基础(LB)培养基中；(3)添加携氧剂：在发酵4-10h后加入体积百分比0.5％-1.5％的十二烷；(4)发酵培养15-25h可认为发酵完毕。在所述步骤(1)中，所采用的待用黄曲霉毒素降解菌为阿耶波多氏芽孢杆菌(Bacillusaryabhattai)DT，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo.14949，保藏日期为2017年11月22日。所述的阿耶波多氏芽孢杆菌DT在申请号为CN201711458433.1的专利技术中已经公布。菌种保存于质量分数为25％甘油中存放在-80℃冰箱中；使用时，先将菌种接种在细菌基础琼脂(LB琼脂)培养基上进行菌种活化，在37℃培养箱培养12～24h，待有菌落形成挑取适量单菌落接种到新的LB琼脂培养基上，在37℃培养箱培养12～24h获得待用的黄曲霉毒素降解菌；在所述步骤(1)中，培养条件为37℃、摇床转速180rpm，培养时间为10-14h；在所述步骤(2)中，将所述种子液以体积百分比2％-10％的比例接种到细菌基础(LB)培养基中，培养温度为37℃，摇床转速220-240rpm；在上述方案中，所述细菌基础(LB)培养基为：氯化钠10.0g/L、酵母浸粉5.0g/L、胰蛋白胨10.0g/L，水为蒸馏水，121℃高压灭菌20min；所述细菌基础琼脂(LB)培养基为：氯化钠10.0g/L、酵母浸粉5.0g/L、胰蛋白胨10.0g/L、琼脂条15～20g/L，水为蒸馏水，121℃高压灭菌20min。在所述步骤(4)中，用发酵20h的上清液降解黄曲霉毒素72h，能显著降低黄曲霉毒素的残留率，具体步骤为：选择37℃、240rpm作为固定发酵条件，且在培养4h后分别加入1％的十二烷，取培养20h的培养液1mL并离心，取900μL上清液和100μL黄曲霉毒素溶液混合，避光37℃消解72h后使用超高压液相色谱(UHPLC)测定残留黄曲霉毒素含量，如图3结果显示，20h上清液黄曲霉毒素残留率明显低于使用菌种降解黄曲霉毒素的实验组，加入十二烷的发酵上清液降解黄曲霉毒素后的毒素残留率相比不加携氧剂的空白对照组降低了24.41％，残留率仅为9.6％。在上述方案中，黄曲霉毒素B1(AFB1)标品购于北京百灵威科技公司；十二烷试剂为国产分析纯。高效液相色谱试剂(甲醇、乙腈等)均为国产色谱纯。本专利技术的有益效果为：用此法能提高毒素降解菌阿耶波多氏芽孢杆菌DT的发酵效率，加入十二烷作为携氧剂得到的目标菌种的发酵上清液能显著的降低黄曲霉毒素的残留率，取目标菌种的上清液900μL并加入100μL的20μg/mLAFB1标准液进行降解后，毒素残留率相比不加携氧剂的空白对照组降低了24.41％，残留率仅为9.6％。附图说明图1为不同摇床转速对DT生长的影响；图2为发酵初始加入1％不同携氧剂对DT生长的影响；图3为发酵初始加入2％不同携氧剂对D本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种黄曲霉毒素降解菌的高效发酵方法，其特征在于：在黄曲霉毒素降解菌的发酵体系中添加合适的携氧剂，步骤如下：/n(1)种子液制备：将待用的黄曲霉毒素降解菌接种到LB培养基中培养得到种子液；所述的黄曲霉毒素降解菌为阿耶波多氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)DT，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.14949，保藏日期为2017年11月22日；/n(2)发酵培养：将步骤(1)所述种子液接种到LB培养基中；/n(3)添加携氧剂：在发酵培养4-10h后加入相对于发酵液体积百分比为0.5％-1.5％的十二烷；/n(4)发酵培养15-25h认为发酵完毕。/n

【技术特征摘要】
1.一种黄曲霉毒素降解菌的高效发酵方法，其特征在于：在黄曲霉毒素降解菌的发酵体系中添加合适的携氧剂，步骤如下：
(1)种子液制备：将待用的黄曲霉毒素降解菌接种到LB培养基中培养得到种子液；所述的黄曲霉毒素降解菌为阿耶波多氏芽孢杆菌(Bacillusaryabhattai)DT，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo.14949，保藏日期为2017年11月22日；
(2)发酵培养：将步骤(1)所述种子液接种到LB培养基中；
(3)添加携氧剂：在发酵培养4-10h后加入相对于发酵液体积百分比为0.5％-1.5％的十二烷；
(4)发酵培养15-25h认为发酵完毕。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：在所述步骤(1)中，培养条件为37℃、摇床转速180rpm，培养时间为10-14h。


3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：在所述步骤(2)中，将所述种子液以体积百分比2％-10％的比例接种到LB培养基中，培养温度为37℃，摇床转速220...

【专利技术属性】
技术研发人员：周文文，韦显雪，王树雯，钱超，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33