一种A型肉毒毒素抑制剂及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一类新型A型肉毒毒素轻链多肽类抑制剂及其制备方法与应用。所述多肽类抑制剂的结构式如式I所示。本发明专利技术通过Fmoc‑固相肽合成法得到线性肽，然后酰胺化关环，纯化后得到目标物。各抑制剂对A型肉毒毒素轻链抑制IC

A botulinum toxin A inhibitor and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种A型肉毒毒素抑制剂及其制备方法与应用
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种A型肉毒毒素抑制剂及其制备方法及其应用。
技术介绍
肉毒毒素(Botulinumneurotoxins，BoNTs)是由革兰氏阳性菌肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)分泌的外毒素，是迄今为止人类发现的毒性最强的生物毒素，被列为重要的生物战剂之一。人类发现的肉毒毒素分为7种血清型(A～G)，其中A、B、E、F型可引起人群中毒，以A型毒性最强且最为常见。其结构可分为重链与轻链。重链可与靶细胞膜表面特异性受体结合，介导轻链进入靶细胞。轻链为其毒性成分，可特异性切割SNARE家族蛋白，阻止乙酰胆碱递质的释放，阻断了神经冲动的传导，引起肌肉麻痹(DuplantierAJ，etal.CurrTopinChem2016；16(21):2330-49)。人类肉毒毒素中毒类型可分为四种(AtassiMZ，etal.CritRevImmunol1999；19(3):219-60)：(1)食源性肉毒毒素中毒；(2)婴儿肉毒毒素中毒；(3)吸入性中毒；(4)创伤性肉毒毒素中毒。目前食源性及婴儿肉毒中毒事件仍时有发生。随着A型肉毒毒素(BoNT/A)在医疗和美容的广泛应用，因使用不当导致的肉毒中毒事件时有发生。目前A型肉毒中毒采取马抗进行治疗，然而马抗存在过敏反应、生产成本高以及低温储存等缺点，且抗毒素只能中和体液、血液中游离毒素，对细胞内的毒素则无抑制效果。肉毒毒素往往在中毒数小时内便可进入神经元，能在神经元中存在数天甚至数月，持续性切割SNARE家族蛋白，阻断乙酰胆碱递质的释放。胞内毒素只能通过人体自身降解被清除，使得病人的治疗周期很长(ThanongsaksrikulJ，etal.Toxins2011；3(5):469-88)。因此，有必要开发小分子抑制剂用于A型肉毒中毒治疗。CPI-1(序列：Dab-(C)RWTKCL-NH2)是目前已知的活性最强BoNT/A轻链多肽类抑制剂(Ki＝39.2±4.6nmol/L)，为含7个天然氨基酸与一个非天然氨基酸Dab(L-2,4-二氨基丁酸)的环肽(AdlerM，etal.BioorgMedChem,2015,23(22):7264-73)。具有作用靶点专一，亲和力较高，水溶性好等优点。然而CPI-1二硫键容易在体内被还原而导致活性丧失。
技术实现思路
为解决CPI-1易在体内还原且抗酶解活性较差的缺点，本专利技术提供了一类新型抑制剂，该类抑制剂比CPI-1的抗酶解能力更强，体外抑制BoNT/A轻链的活性比CPI-1稍低(见表1)，但体内对BoNT/A的解毒显著效果优于CPI-1(见表2)。同时，对多肽进行改造，在其C端引入疏水氨基酸或碱性氨基酸，进一步提高了突变肽的抑制活性(见表1)。本专利技术还提供了上述抑制剂在制备A型肉毒毒素解毒剂中的应用。本专利技术所采取的技术方案为通过设计一个包含胱硫醚或双氨基的linker，对CPI-1序列中半胱氨酸的位置进行替换，引入碳碳键或碳硫键替换二硫键作为骨架结构，进一步在多肽的C端引入疏水氨基酸及碱性氨基酸。本专利技术所提供的新型环状多肽抑制剂的序列通式如下：Dab-RWTK-X-L-Z-NH2其中：Dab代表L-2,4-二氨基丁酸，R代表精氨酸，W代表色氨酸，T代表苏氨酸，K代表赖氨酸，L代表亮氨酸；X为实验室前期合成的linker分子；所述X选自下述X1、X2和X3中除去All保护基、Aloc保护基及Fmoc保护基的剩余基团中的任意一个基团：Z选自色氨酸、精氨酸、亮氨酸中的任意一个或空缺。通式具体为以下多肽，其序列如下：多肽1：Dab-RWTK-X1-L-NH2；多肽2：Dab-RWTK-X2-L-NH2；多肽3：Dab-RWTK-X3-L-NH2；多肽4：Dab-RWTK-X1-L-W-NH2；多肽5：Dab-RWTK-X1-L-R-NH2；多肽6：Dab-RWTK-X1-L-L-NH2。以上任一所述多肽为C末端乙酰化修饰的多肽。为了更清楚的表述所述多肽抑制剂中各基团的连接关系，本专利技术所提供的新型多肽抑制剂的结构通式如式I所示：其中，X、Y均选自CH2和S中的任一种，但X、Y不同时为S；Z选自下述基团中的任一种：色氨酸酰氨基(Trp-NH2)、精氨酸酰氨基(Arg-NH2)、亮氨酸酰氨基(Leu-NH2)、氨基。更具体的，所述多肽抑制剂为下述任一所述的多肽：1)X＝CH2，Y＝S，Z＝NH2；(多肽1)2)X＝S，Y＝CH2，Z＝NH2；(多肽2)3)X＝CH2，Y＝CH2，Z＝NH2；(多肽3)4)X＝CH2，Y＝S，Z＝Trp-NH2；(多肽4)5)X＝CH2，Y＝S，Z＝Arg-NH2；(多肽5)6)X＝CH2，Y＝S，Z＝Leu-NH2；(多肽6)本专利技术还提供了上述多肽抑制剂的制备方法。所述多肽抑制剂的合成原料均为Fmoc(芴甲氧羰酰基)保护氨基酸：L为Fmoc-Leu-OH；C为Fmoc-Cys(Trt)-OH；K为Fmoc-Lys(Boc)-OH；T为Fmoc-Thr(tBu)-OH；R为Fmoc-Arg(Pbf)-OH；W为Fmoc-Trp(Boc)-OH；Dab为Boc-Dab(Fmoc)-OH。本专利技术所提供的制备新型多肽抑制剂的方法，包括下述步骤：1)采用Fmoc固相合成法合成线性肽，所述线性肽的序列如下：Dab-RWTK-X-L-Z-NH2；其中，X、Z的定义同式I；所述线性肽为N端带Fmoc保护的肽树脂；所述线性肽的N端为Dab端；2)多肽的环化：Pd加氢催化脱去所述线性肽中X侧链的All保护基及Aloc保护基，然后在碱性条件下脱去N端的Fmoc保护基，经内酰胺反应环化得到环肽；3)多肽的裂解：将所述环肽经裂解脱去其余侧链保护基及树脂得到粗肽。上述使用的氨基酸原料均为Fmoc保护氨基酸：L为Fmoc-Leu-OH；K为Fmoc-Lys(Boc)-OH；T为Fmoc-Thr(tBu)-OH；R为Fmoc-Arg(Pbf)-OH；W为Fmoc-Trp(Boc)-OH；Dab为Boc-Dab(Fmoc)-OH。所有上述反应均在固相载体上完成。上述方法步骤2)中，所述环化在DMF溶剂中进行。所述环化的具体条件为：向合成管中加入PyBoP、HoBt，NMM、DMF，其中，PyBoP、HoBt，NMM与肽的摩尔比依次为5:5:10。上述方法步骤3)中，所述裂解采用的裂解液由TFA(三氟乙酸)/H2O/DTT(二硫苏糖醇)/TIS(三异丙基硅烷)组成，其配比依次为：4.4mL/0.25g/0.25g/0.1mL。粗肽经反向色谱柱纯化后得到产物。纯化过程具体为：流动相由流动相A与流动相B组成；流动相A：含0.1％TFA的去离子水，流动相B：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.结构通式如式I所示的多肽：/n

【技术特征摘要】
1.结构通式如式I所示的多肽：



其中，X、Y均选自CH2和S中的任一种，但X、Y不同时为S；
Z选自下述基团中的任一种：色氨酸酰氨基、精氨酸酰氨基、亮氨酸酰氨基和氨基。


2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：所述多肽具体选择下述任意一种：
1)X＝CH2，Y＝S，Z＝NH2；
2)X＝S，Y＝CH2，Z＝NH2；
3)X＝CH2，Y＝CH2，Z＝NH2；
4)X＝CH2，Y＝S，Z＝Trp-NH2；
5)X＝CH2，Y＝S，Z＝Arg-N...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴秋云，沈锦涛，余硕，刘佳，余云舟，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11