一种益智高效再生体系建立的方法技术

本发明专利技术公开了一种益智高效再生体系建立的方法，该方法包括外植体采集与消毒、单芽诱导、丛生芽诱导、丛生芽增殖、壮苗培养、生根培养、生根苗炼苗和生根苗移栽。本发明专利技术工艺流程简单，瓶苗生长整齐健壮，增殖倍率高且稳定，生根苗移栽成活率高，苗木定植后生长结果良好，实现了益智离体高效再生，适用于益智商业化育苗生产。

A method to establish a high efficient regeneration system for intelligence

【技术实现步骤摘要】
一种益智高效再生体系建立的方法
本专利技术涉及一种基于益智离体培养技术的高效再生体系建立方法，属于作物栽培与生理生化领域。
技术介绍
益智（AlpiniaoxyphyllaMiq），又名益智仁、益智子，属姜科山姜属多年生草本植物。益智为传统南药，以干燥果实供药用，有益脾胃，理元气，补肾虚滑沥的功用。治脾胃（或肾）虚寒所致的泄泻，腹痛，呕吐，食欲不振，唾液分泌增多，遗尿，小便频数等症。主要分布于广东、广西、海南，在云南和福建有少量分布。益智为半阴生植物，生长适宜郁闭度为30%~50%，可在橡胶林、油茶林及其他林木下种植，在保证林农经济利益前提下，有效缩短非投产期，具备良好的推广应用前景。益智种苗繁殖通常采用种子繁殖和分株繁殖的方式。异花授粉植物实生苗性状分离严重，个体差异大；分株繁殖虽然能保持母本优良性状，但繁殖系数极低，不能在短时间内繁殖出大量种苗，满足不了种苗市场需求。益智高效离体再生体系，以益智优良单株笋芽为原始材料，通过诱导丛生芽增殖成苗，将优良单株无性系化，有效保证了苗木的遗传稳定性，每月增殖倍数可达3.5~4.0倍，有利于益智良种苗木稳定生产和集约化经营。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种益智高效再生体系建立的方法，该方法可实现益智优势单株无性系化、良种苗木稳定快速繁殖。为达到目的，本专利技术提供的一种益智高效再生体系建立的方法，该方法包括以下步骤：1）外植体采集与消毒：选择生长结果良好的益智优势单株，于晴天正午挖取益智未展叶笋芽，去土去根，在笋芽苞片与姜块交界处切断，保湿带回实验室；将采集的外植体置于饱和漂白粉溶液中浸泡25~35min，无菌水漂洗2次，转移至0.1%升汞溶液处理15~25min，使用无菌水漂洗4次以上，将漂洗干净的外植体进行第二次切割，将笋芽外层苞片剥离，切除接触升汞溶液的部分，从中轴纵切成两半，接种到空白MS培养基；该培养基附加蔗糖30g/L、卡拉胶6g/L，灭菌前pH调节为5.8，灭菌温度121℃、压力1.1kg/cm2、灭菌时间20min，培养环境为温度27℃±1℃，光照1500~2000lx，光照时间为12h/d；2）单芽诱导：笋芽经过10~15d培养，剔除污染，将无菌笋芽接种到配方为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L的启动培养基培养，培养时间30d；3）丛生芽的诱导：将步骤2）获得的生长状况良好的单芽接种取出，在无菌条件下切除单芽基部愈伤组织，将单芽转接至丛生芽诱导培养基；接种30d后，将原接种单芽纵切为带一半原单芽及部分不定芽的组织块，剔除愈伤组织后，转移至相同培养基，继续培养30d形成密集的丛生芽；4）丛生芽增殖：将步骤3）获得的密集丛生芽，切割为带5~8个不定芽的组织块，接种至丛生芽增殖培养基；培养30d后，原接种组织块体积迅速增加，不定芽形成1.5~2cm且生长健壮的丛生芽，丛生芽高生长同时，基部形成较多的不定芽，实现迅速增殖；丛生芽增殖30d继代转接1次，整个繁育周期共重复继代15~20次；5）壮苗培养：将步骤4）获得的健壮丛生芽，切割为带3~5个健壮单芽的组织块，接种至壮苗培养基，培养30d；6）生根培养：将步骤5）获得的单芽切割分级，植株高度在3.0~4.0cm的单芽接种至生根培养基，植株高度小于3.0cm的单芽重新接种至步骤5）壮苗培养基；生根苗接种后1~15d，光照12h/d；接种后16~30d，光照14h/d；7）生根苗炼苗：将步骤6获得的生根苗，带瓶置于温室内进行炼苗10~15d，炼苗棚温度20~35℃，晴天9:00~16:30炼苗棚棚顶遮阳，其余时间遮阳网全开透光，阴雨天全天透光；8）生根苗移栽：将炼苗完成的生根苗洗净根部培养基，使用多抗霉素800~1000倍液+s-诱抗素1500~2000倍液浸泡苗木10~15min，不经漂洗即可移栽；移栽使用72孔穴盘，基质使用体积比泥炭土：珍珠岩=9:1混合均匀，定植前使用敌磺钠600~800倍液浇透基质，定植完成后使用500目以上花洒或喷雾器浇定根水，定植后7~10d使用多菌灵600~800倍液+复硝酚钠1500~2000倍液喷撒植株及基质表面；育苗床需覆盖透光率75%遮阳网；其中，启动培养基培养的蔗糖用量与步骤1）相同，未加以说明的培养基中的pH调节、灭菌方法均与步骤1）相同，未加以说明的培养环境均与步骤1）相同。本专利技术的意义：本专利技术所提供的益智离体高效再生体系，可将益智优选单株无性系化，保持母本优良性状，苗木均一稳定，为栽培整齐度及预期产量奠定了良好基础；使用笋芽萌发丛生芽为继代材料，不使用愈伤组织成苗方式，有效控制了生产过程中的变异；本专利技术只需少量母本笋芽进入再生环节，即可呈几何倍数增殖，克服了种源数量对出苗数量的限制，有效降低了生产成本；在离体培养过程中，对真菌和细菌病害起到了较好的脱毒效果，有利于益智健康种苗生产。本专利技术工艺流程简单，可操作性强，效果稳定且生产成本低，具备推广优势。具体实施方式下面以实施例对本专利技术作进一步说明。实施例：1）外植体采集与处理：2017年12月20日正午，采集益智优良地方品种双滘四号笋芽。地点为广东农垦热带作物科学研究所益智种质圃，采芽母本植株健壮，株型紧凑，果穗密集，无病虫害，侧芽饱满。将经过修剪清洗的外植体置于饱和漂白粉溶液中浸泡30min，无菌水漂洗2次，转移至0.1%升汞溶液处理20min，使用无菌水漂洗6次，将漂洗干净的外植体进行第二次切割，将笋芽外层苞片剥离，切除接触升汞溶液的部分，从中轴纵切成两半，接种到空白MS培养基，该培养基附加蔗糖30g/L、卡拉胶6g/L，灭菌前pH调节为5.8，灭菌温度121℃、压力1.1kg/cm2灭菌时间20min（后续培养基，如无特殊说明，卡拉胶用量、pH调节，灭菌方法均与此相同），培养环境为温度27℃±1℃，光照1500~2000lx，光照时间为12h/d（后续培养环境，如无特殊说明，均与此相同）。2）益智单芽的诱导：2018年1月4日，将无菌笋芽接种到配方为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L的启动培养基培养。2018年1月15日观察，笋芽出现可见生长，顶端伸长，基部膨大，产生少量愈伤组织；2018年2月3日观察，笋芽顶端伸长并形成完整单芽，部分侧芽萌发形成完整单芽，笋芽基部明显膨大并伴生少量愈伤组织。3）益智丛生芽的诱导：2018年2月3日，将获得的生长状况良好的单芽接种取出，在无菌条件下切除单芽基部愈伤组织，转接至配方为1.2MS+6-BA3.0mg/L+TDZ0.6mg/L，该培养基大量元素提高20%，蔗糖用量45g/L。2018年3月5日转接，单芽基部膨大，产生少量不定芽，将原接种单芽纵切为带一半原单芽及部分不定芽的组织块，转移至相同培养基，愈伤组织剔除；转接30d后，组织块膨大，产生大量不定芽，形成密集的丛生芽。4）益智丛生芽增殖：2018年4月5日，将获得的密集丛生芽，切割为带5个不定芽的组织块，接种至丛生芽增殖培养基，该培养基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种益智高效再生体系建立的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：/n1）外植体采集与消毒：选择生长结果良好的益智优势单株，于晴天正午挖取益智未展叶笋芽，去土去根，在笋芽苞片与姜块交界处切断，保湿带回实验室；将采集的外植体置于饱和漂白粉溶液中浸泡25~35min，无菌水漂洗2次，转移至0.1%升汞溶液处理15~25min，使用无菌水漂洗4次以上，将漂洗干净的外植体进行第二次切割，将笋芽外层苞片剥离，切除接触升汞溶液的部分，从中轴纵切成两半，接种到空白MS培养基；该培养基附加蔗糖30g/L、卡拉胶6g/L，灭菌前pH调节为5.8，灭菌温度121℃、压力1.1 kg/cm

【技术特征摘要】
1.一种益智高效再生体系建立的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
1）外植体采集与消毒：选择生长结果良好的益智优势单株，于晴天正午挖取益智未展叶笋芽，去土去根，在笋芽苞片与姜块交界处切断，保湿带回实验室；将采集的外植体置于饱和漂白粉溶液中浸泡25~35min，无菌水漂洗2次，转移至0.1%升汞溶液处理15~25min，使用无菌水漂洗4次以上，将漂洗干净的外植体进行第二次切割，将笋芽外层苞片剥离，切除接触升汞溶液的部分，从中轴纵切成两半，接种到空白MS培养基；该培养基附加蔗糖30g/L、卡拉胶6g/L，灭菌前pH调节为5.8，灭菌温度121℃、压力1.1kg/cm2、灭菌时间20min，培养环境为温度27℃±1℃，光照1500~2000lx，光照时间为12h/d；
2）单芽诱导：笋芽经过10~15d培养，剔除污染，将无菌笋芽接种到配方为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L的启动培养基培养，培养时间30d；
3）丛生芽的诱导：将步骤2）获得的生长状况良好的单芽接种取出，在无菌条件下切除单芽基部愈伤组织，将单芽转接至丛生芽诱导培养基；接种30d后，将原接种单芽纵切为带一半原单芽及部分不定芽的组织块，剔除愈伤组织后，转移至相同培养基，继续培养30d形成密集的丛生芽；
4）丛生芽增殖：将步骤3）获得的密集丛生芽，切割为带5~8个不定芽的组织块，接种至丛生芽增殖培养基；培养30d后，原接种组织块体积迅速增加，不定芽形成1.5~2cm且生长健壮的丛生芽，丛生芽高生长同时，基部形成较多的不定芽，实现迅速增殖；丛生芽增殖30d继代转接1次，整个繁育周期共重复继代15~20次；
5）壮苗培养：将步骤4）获得的健壮丛生芽，切割为带3~5个健壮单芽的组织块，接种至壮苗培养基，培养30d；
6）生根培养：将步骤5）获得的单芽切割分级，植株高度在3.0~4.0cm的单芽接种至生根培养基，植株高度小于3.0cm的单芽重新接种至步骤5）壮苗培养基；生根苗接种后1~15d，光照12h/d；接种后16~30d，光照14h/d；
7）生根苗炼苗：将步骤6）获得的生根苗，带瓶置于温室内进行炼苗10~15d，炼苗棚温度20~35℃，晴天9:...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁秋玲，张能，谢黎黎，陈士伟，郭振粤，陈海坚，黄明超，班恒英，袁克艳，黄梅花，郭金平，叶青，郑凤娟，
申请(专利权)人：广东农垦热带作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44