一种氟苯尼考快速检测试剂盒及检测方法技术

一种氟苯尼考快速检测试剂盒：该试剂盒以胶体金为标记物，采用竞争抑制原理，建立了高灵敏的氟苯尼考胶体金免疫层析定量检测方法。本发明专利技术利用胶体金免疫层析技术，在硝酸纤维素膜上包被氟苯尼考抗原（测试线）和羊抗鼠IgG（质控线），将标记好的氟苯尼考金标抗体喷在金标垫上，处理好的鸡蛋样本流经NC膜时，在NC膜上显示出红色线条，根据是否存在检测线（T线）来判断样本中是否含有氟苯尼考。

A rapid test kit and method for Florfenicol

【技术实现步骤摘要】
一种氟苯尼考快速检测试剂盒及检测方法
本专利技术涉及食品安全领域，具体涉及一种氟苯尼考检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
氟苯尼考(Florfenicol，FF)又称氟甲砜霉素，是美国先灵-葆雅公司于1988年研制成功的一种新型兽医专用氯霉素类广谱抗菌药，被广泛用于水产和畜禽养殖中。研究表明，氟苯尼考具有血液系统毒性、胚胎毒性和免疫抑制作用，动物用药后会出现短暂的厌食、腹泻等不良反应。在养殖过程中，氟苯尼考的过度使用会造成其在动物性食品中产生残留，进而对消费者的身体健康构成潜在威胁，并导致耐药菌的产生。因此，各国相继规定了氟苯尼考在动物性食品中最高残留限量标准.氟苯尼考具有一定的免疫毒性和胚胎毒性，用药后还会出现厌食、腹泻等不良反应。产蛋家禽中使用氟苯尼考，可能导致在禽蛋中残留。氟苯尼考对鸡的生殖系统有消炎作用，但同时会轻度抑制生殖激素的产生，造成鸡蛋早期胚胎的死亡。中国农业部第235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》规定，氟苯尼考作为广谱抗菌药物，可用于猪、牛、羊、禽、鱼等禽畜，但特别规定“家禽（产蛋禁用）”，从检验角度，鸡肉、皮、脂、肝、肾中允许检出，但鸡蛋中不得检出。美国相关法规标准规定，氟苯尼考可用于猪、牛、鱼；欧盟则只允许用于鱼类。目前，氟苯尼考的检测方法主要有高效液相色谱法、气相色谱法、液相色谱-质谱联用法、气相色谱-质谱联用法和酶联免疫吸附法。这些方法的灵敏度高，重现性好，其中国家标准方法为液相色谱-质谱联用法，但样品的前处理比较复杂、耗时较长，需要专业人员且需要特定的仪器设备。>
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决上述问题而提供。本专利技术采用竞争免疫层析原理。当样品中不含有氟苯尼考时(阴性样本)，金标抗体在毛细管作用下沿着NC膜移动并被固定在T线上的FF-BSA捕获。当样品中含有FF时(阳性样本)，金标抗体与样本溶液中的FF结合而不能被固定在T线上的FF-BSA捕获，T线信号强度随着样本中FF浓度的增加而降低。剩余的金标抗体会与固定在C线上的羊抗鼠二抗结合。本专利技术通过以下技术方案实现：鸡蛋样品的前处理方式由传统的氮气吹干改为样本处理液直接提取的方式，其中样本处理液：0.2M硼酸缓冲液（pH9.0），0.4%曲拉通X-100(体积分数)，0.05%酪蛋白钠（质量分数）。硼砂缓冲液，主要起缓冲作用，稳定整个体系的pH；曲拉通使样本能够在试纸条上均匀的爬动；酪蛋白主要就是减少样本中的基质干扰。快速检测卡：取0.2mg/mL氟苯尼考-BSA抗原和0.6mg/mL羊抗鼠多克隆抗体，采用三维喷点平台以0.76μL/cm的喷量喷于NC膜上，分别作为检测线(T线)和质控线(C线)。将喷好的NC膜置于37℃真空干燥箱中干燥2h。在底板(PVC板)上依次粘贴样本垫、结合垫、NC膜、吸收垫，并切成4mm宽的试纸条。取2μL金标抗体溶液和100μL样品溶液加入到酶标孔中，孵育3min后滴加到试纸条的样本垫上，15min后用胶体金试纸条读取仪测定结果。利用胶体金免疫层析技术，在硝酸纤维素膜上包被氟苯尼考抗原（测试线）和羊抗鼠IgG（质控线），将标记好的氟苯尼考金标抗体喷在金标垫上，处理好的鸡蛋样本流经NC膜时，在NC膜膜上显示出红色线条,根据仪器读取红颜色深浅来判断样本中氟苯尼考的浓度。有益效果1.提取液中无有机试剂、不需要离心，氮吹等复杂步骤，整个过程中，不需要其他辅助设备就能完成检测。2.提取液作为样品垫处理液时，本专利技术的处理液能够显著降低待测样品中的基质效应，从而使抗原和和抗体能够正常结合并且具备良好的灵敏度和特异性，进而使得本专利技术的检测试剂能够适用于氟苯尼考的现场检测。附图说明图1检测不同浓度的氟苯尼考的胶体金试纸条显色情况，从左往右，每三个试纸条一组，三组为三个重复，每组包括阴性和两个浓度氟苯尼考样品。图2氟苯尼考试纸条结果判断示意图。具体实施方式下面结合附图和实施方式对本专利技术做进一步的详细说明。以下实施例仅是范例性的，仅用以对本专利技术的技术方案做更进一步的详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，在不偏离本专利技术技术方案的精神和范围内，对技术方案进行的修改或者替换均应涵盖在本专利技术的权利要求保护范围内。实施例一胶体金检测卡的制备1.制备胶体金溶液（柠檬酸三钠还原法）：取0.01%氯金酸水溶液100mL，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，持续搅拌的情况下加入1%柠檬酸三钠水溶液2.5mL，继续搅拌加热10min，溶液呈透亮的红色。室温冷却,用去离子水恢复到原体积,4℃保存备用。2.单克隆抗体的标记：取已制备好的胶体金溶液100mL，用0.1mol/L碳酸钾溶液调pH到8.0。边搅拌边加入鼠抗氟苯尼考单抗2mg，搅拌15min，逐滴加入2.5mL的25mg/mL聚乙二醇20000(PEG20000)，搅拌20min。20000r/min离心20min,弃上清液,加入10mLpH7.4PBS缓冲液(含0.4mg/mLPEG)清洗2次。将沉淀用5mL质量分数为2%BSA的PBS缓冲液(pH7.4)溶解，用0.22μm无菌过滤器过滤后，4℃保存备用。3.检测卡的制备：取0.2mg/mL氟苯尼考-BSA抗原和0.6mg/mL羊抗鼠多克隆抗体，采用三维喷点平台以0.76μL/cm的喷量喷于NC膜上，分别作为检测线(T线)和质控线(C线)。将喷好的NC膜置于37℃真空干燥箱中干燥2h。在底板(PVC板)上依次粘贴样本垫、结合垫、NC膜、吸收垫，并切成4mm宽的试纸条。样品处理液：1.硼酸盐缓冲液：硼酸（H3BO3）：0.2mol/L硼酸：硼酸12.37g加水至1000mL,硼砂（Na2B4O7）：0.05mol/L硼砂：硼砂19.07g加水至1000mL；2.取0.2mol/L硼酸8.0mL,0.05mol/L硼砂2.0mL混合，混合后加入0.4%曲拉通X-100(体积分数)，0.05%酪蛋白钠（质量分数）即得。实施例二.试剂盒检测鸡蛋样本称取1g搅匀的鸡蛋样本至10mL离心管中，加入2mL样本提取液，涡旋1min，取混合液4滴，加入到氟苯尼考检测卡的样本孔中进行检测。取出检测卡，开封后平放于桌面，在检测前先用样本提取液润湿检测卡的样品垫，然后使用本产品附带滴管吸取待检液，加入4滴于点样孔中；加样后5~8min，观察显色区，判定结果，对于判定的结果通过分析仪器进一步判断样品中氟苯尼考浓度。结果判定原则：阴性：C线显色，T线肉眼可见，无论颜色深浅均判为阴性。阳性：C线显色，T线不显色，判为阳性。无效：C线不显色，无论T线是否显色，该检测卡均判为无效。对比实施例一取均质样本3g，匀浆后，加乙酸乙酯6mL，振荡10min后，室温下4000r/min离心10min。取4mL上层有机相，50℃下用氮吹仪吹干，加入正已烷1mL，涡旋混匀30s，再加入0.01mol/LPBS缓冲液(pH7．4)1mL，涡旋混匀1min后，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种氟苯尼考快速检测试剂盒，包括样品处理液和检测试纸条，其中检测试纸条包括塑料背衬，背衬前端设置有样品垫，样品垫通过结合垫与硝酸纤维素膜前端连接，硝酸纤维素膜后端与吸水垫相连，结合垫上含有胶体金标记的鼠抗氟苯尼考单克隆抗体，硝酸纤维素膜上有包被有氟苯尼考-BSA偶联物的检测线（C线）和羊抗鼠IgG控制线（T线），其特征在于样本处理液由0.2M硼酸缓冲液（pH9.0），0.4%曲拉通X-100(体积百分数)，0.05%酪蛋白钠组成（质量百分数）。/n

【技术特征摘要】
1.一种氟苯尼考快速检测试剂盒，包括样品处理液和检测试纸条，其中检测试纸条包括塑料背衬，背衬前端设置有样品垫，样品垫通过结合垫与硝酸纤维素膜前端连接，硝酸纤维素膜后端与吸水垫相连，结合垫上含有胶体金标记的鼠抗氟苯尼考单克隆抗体，硝酸纤维素膜上有包被有氟苯尼考-BSA偶联物的检测线（C线）和羊抗鼠IgG控制线（T线），其特征在于样本处理液由0.2M硼酸缓冲液（pH9.0），0.4%曲拉通X-100(体积百分数)，0.05%酪蛋白钠组成（质量百分数）。


2.如权利要求1所述的氟苯尼考检测试剂盒的使用方法，其特征在于包括以下步骤：（1）使用样品处理液对待检测食品样本进行稀释提取，（2）将样品垫用样本处理液预先润湿，在完成上述两个步骤后，（3）将样品处理液提取的样本滴加到检测试纸条的样品垫上，过5-10分钟后观察硝酸纤维素膜上的显色情况。


3.如权利要求1所述的氟苯尼考的检测试剂盒在检测食品样本中氟苯尼考含量中的应用，其特征在于：检测样品为鸡蛋，鸭蛋，鹅蛋，鹌鹑蛋等禽蛋。


4.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所...

【专利技术属性】
技术研发人员：周陶鸿，李诗瑶，刘艳，华权高，余箭翔，夏欣，闫彩霞，
申请(专利权)人：武汉华美生物工程有限公司，湖北省食品质量安全监督检验研究院，
类型：发明
国别省市：湖北;42