一种高通量检测多个待测样本中不同目的蛋白含量的方法及其专用试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种高通量检测多个待测样本中不同目的蛋白含量的方法及其专用试剂盒。本发明专利技术的发明专利技术人结合PEA和DNA测序技术可实现对多样本多蛋白含量的同时检测，具体方法为：针对不同种类的抗体标记不同序列的ss‑DNA(蛋白条码)，由ss‑DNA序列的不同来区分蛋白种类；借助PEA技术将蛋白信息转化为DNA信息；建库时针对不同的样本再加上一段不同的Barcode标记序列(样本条码)，用于区分不同样本；测序仪分别检测出样本条码序列、蛋白条码序列以及蛋白条码序列的数目，由此便实现了多个样本多种蛋白含量的同时检测。本发明专利技术具有重要的应用价值。

A high-throughput method for the determination of different target proteins in multiple samples and its special kit

【技术实现步骤摘要】
一种高通量检测多个待测样本中不同目的蛋白含量的方法及其专用试剂盒
本专利技术属于生物
，具体涉及一种高通量检测多个待测样本中不同目的蛋白含量的方法及其专用试剂盒。
技术介绍
对于多蛋白微量检测的方法主要有路明克斯(Luminex)技术、伯乐悬浮芯片(bioradbio-plex)技术和蛋白芯片技术。Luminex技术综合了微球和流式细胞仪，利用带有颜色编码的微球共价交联单克隆抗体，与被测定的目标分子结合后加入荧光素标记的检测抗体，再通过激光扫描荧光编码来识别单个微球和检测荧光强度来确定被测分子的浓度。由于不同颜色编码的微球可以用来检测不同的蛋白，这样在一次实验中可以同时完成多个目标分子的分析。但检测仪器昂贵，检测试剂中需用到生物修饰的荧光微球，同时检测样本量为10-20μL，反应抗体耗量多，导致最终检测成本过高。bioradbio-plex技术综合了微球和悬浮芯片技术：在液相芯片中，把针对不同检测物的不同颜色微球(微球上有针对不同检测物的蛋白质)混合，然后加入被检测物，在悬液中微球与被检测物特异性结合，并加上荧光标记，从而在同一反应体系中可以同时对同一份标本的多个指标进行检测。该方法可检测同一样本中的多种蛋白，却不能对多份含有多个指标的标本进行同时检测。此外，由于借鉴了Luminex的微球技术，同样会造成试剂成本高的问题。蛋白芯片技术是将已知的多种的蛋白分子同时固定在不同种类的固相载体上，制成的高密度蛋白微阵列。通常先把待测蛋白质分子与芯片进行一段时间的孵育反应，再加入标记好的蛋白分子，使之与芯片-蛋白分子复合物进行反应。由于每个分子的位置及序列为己知的，通过生物芯片扫描仪检测蛋白的浓度或存在情况便可以知道各种蛋白分子的分布情况。这种方法的优点是可作为一种定量检测方法，并且保证了蛋白质的高级结构可以被检测到；缺点是有时很难找到一对能连接在相同分子上并且匹配的蛋白分子，此外使用该方法难以制备高密度的微阵列，要实现高通量的检测具有很大的挑战性。邻位延伸分析技术(ProximityExtensionAssay，PEA)是在一对抗体上分别修饰上单链DNA(ss-DNA)，当待检测的蛋白分子与抗体发生特异性反应后，拉近了抗体对上ss-DNA的距离，继而产生可扩增的检测信号，从而将蛋白质的检测转变成对DNA的检测，实现了微量蛋白的分析。同时对多种不同序列的DNA进行定量的方法一般采用实时荧光定量PCR(QuantitativeReal-timePCR，QPCR)。
技术实现思路
本专利技术的目的是同时检测多个待测样本中不同目的蛋白含量。本专利技术首先保护一种检测待测样本中不同目的蛋白含量的试剂盒，可包括若干个用于检测不同目的蛋白的试剂、建库PCR上游引物、建库PCR下游引物、测序引物甲和测序引物乙；每个用于检测目的蛋白的试剂可包括单链DNA分子甲、目的蛋白抗体甲、单链DNA分子乙和目的蛋白抗体乙；所述单链DNA分子甲从5’末端到3’末端依次可包括DNA片段1、DNA片段2和DNA片段3；所述单链DNA分子乙从5’末端到3’末端依次可包括DNA片段4、DNA片段5和DNA片段6；所述DNA片段3和所述DNA片段6反向互补；每个用于检测目的蛋白的试剂中，所述DNA片段2和所述DNA片段5的核苷酸序列均不同，用于检测不同的目的蛋白；所述建库PCR上游引物从5’末端到3’末端依次可包括DNA片段a和DNA片段b；所述DNA片段b和所述DNA片段1完全一致；所述建库PCR下游引物从5’末端到3’末端依次可包括DNA片段c和DNA片段d；所述DNA片段d和所述DNA片段4的5’末端完全一致；所述测序引物甲从5’末端到3’末端依次可包括DNA片段X和DNA片段Y；所述DNA片段X与所述DNA片段c反向互补，所述DNA片段Y与所述DNA片段a完全一致；所述测序引物乙与所述DNA片段4序列反向互补。上述试剂盒中，所述单链DNA分子甲从5’末端到3’末端具体可由DNA片段1、DNA片段2和DNA片段3组成。所述单链DNA分子乙从5’末端到3’末端具体可由DNA片段4、DNA片段5和DNA片段6组成。上述试剂盒中，所述建库PCR上游引物从5’末端到3’末端具体可由所述DNA片段a(测序接头序列甲)和所述DNA片段b组成。在本专利技术的实施例中，采用BGI500平台测序进行测序。相应的，测序接头序列甲的核苷酸序列(从5’至3’)可为GAACGACATGGCTACGATCCGACTT。建库PCR上游引物中，添加测序接头序列甲的目的是为了便于进行测序，用于检测单链DNA分子甲和单链DNA分子乙的延伸产物，获得蛋白条码(目的为区分不同蛋白)的信息。根据测序平台的不同，也可以替换成由其它核苷酸序列组成的测序接头序列。上述试剂盒中，所述建库PCR下游引物从5’末端到3’末端具体可由所述DNA片段c(测序接头序列乙)和所述DNA片段d组成。在本专利技术的实施例中，采用BGI500平台测序进行测序。相应的，测序接头序列乙的核苷酸序列(从5’至3’)可为TGTGAGCCAAGGAGTTG。根据测序平台的不同，也可以替换成由其它核苷酸序列组成的测序接头序列。上述试剂盒中，所述测序引物甲从5’末端到3’末端具体可由所述DNA片段X和所述DNA片段Y组成。上述试剂盒中，所述目的蛋白抗体甲和所述目的蛋白抗体乙可以一个为目的蛋白捕获抗体，一个为目的蛋白检测抗体。上述试剂盒中，所述用于检测不同目的蛋白的试剂之间没有交叉反应。上述任一所述试剂盒具体可由若干个用于检测不同目的蛋白的试剂、建库PCR上游引物、建库PCR下游引物、测序引物甲和测序引物乙组成。每个用于检测目的蛋白的试剂具体可由所述单链DNA分子甲、所述目的蛋白抗体甲、所述单链DNA分子乙和所述目的蛋白抗体乙组成。所述DNA片段1和所述DNA片段4均可为20-35个(如20-23个、23-32个、32-35个、20个、23个、32个或35个)核苷酸组成的单链DNA分子。所述DNA片段2和所述DNA片段5均可为5-9个(如5-7个、7-9个、5个、7个或9个)核苷酸组成的单链DNA分子。所述DNA片段3和所述DNA片段6均可为5-11个(如5-9个、9-11个、5个、9个或11个)核苷酸组成的单链DNA分子。所述DNA片段a可为15-30个(如15-25个、25-30个、15个、25个或30个)核苷酸组成的单链DNA分子。所述DNA片段c可为15-30个(如15-17个、17-30个、15个、17个或30个)核苷酸组成的单链DNA分子。上文中，所述DNA片段d和所述DNA片段4的5’末端完全一致具体可为所述DNA片段d和所述DNA片段4的5’末端的20-35个(如20-23个、23-32个、32-35个、20个、23个、32个或35个)核苷酸完全一致，具体可为21个核苷酸完全一致。所述单链DNA分子甲可为30-50个(如30-39个、39-50个、30个、30个或50个)核苷酸组本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测待测样本中不同目的蛋白含量的试剂盒，包括若干个用于检测不同目的蛋白的试剂、建库PCR上游引物、建库PCR下游引物、测序引物甲和测序引物乙；/n每个用于检测目的蛋白的试剂包括单链DNA分子甲、目的蛋白抗体甲、单链DNA分子乙和目的蛋白抗体乙；/n所述单链DNA分子甲从5’末端到3’末端依次包括DNA片段1、DNA片段2和DNA片段3；/n所述单链DNA分子乙从5’末端到3’末端依次包括DNA片段4、DNA片段5和DNA片段6；/n所述DNA片段3和所述DNA片段6反向互补；/n每个用于检测目的蛋白的试剂中，所述DNA片段2和所述DNA片段5的核苷酸序列均不同，用于检测不同的目的蛋白；/n所述建库PCR上游引物从5’末端到3’末端依次包括DNA片段a和DNA片段b；所述DNA片段b和所述DNA片段1完全一致；/n所述建库PCR下游引物从5’末端到3’末端依次包括DNA片段c和DNA片段d；所述DNA片段d和所述DNA片段4的5’末端完全一致；/n所述测序引物甲从5’末端到3’末端依次包括DNA片段X和DNA片段Y；所述DNA片段X与所述DNA片段c反向互补，所述DNA片段Y与所述DNA片段a完全一致；/n所述测序引物乙与所述DNA片段4序列反向互补。/n...

【技术特征摘要】
1.一种检测待测样本中不同目的蛋白含量的试剂盒，包括若干个用于检测不同目的蛋白的试剂、建库PCR上游引物、建库PCR下游引物、测序引物甲和测序引物乙；
每个用于检测目的蛋白的试剂包括单链DNA分子甲、目的蛋白抗体甲、单链DNA分子乙和目的蛋白抗体乙；
所述单链DNA分子甲从5’末端到3’末端依次包括DNA片段1、DNA片段2和DNA片段3；
所述单链DNA分子乙从5’末端到3’末端依次包括DNA片段4、DNA片段5和DNA片段6；
所述DNA片段3和所述DNA片段6反向互补；
每个用于检测目的蛋白的试剂中，所述DNA片段2和所述DNA片段5的核苷酸序列均不同，用于检测不同的目的蛋白；
所述建库PCR上游引物从5’末端到3’末端依次包括DNA片段a和DNA片段b；所述DNA片段b和所述DNA片段1完全一致；
所述建库PCR下游引物从5’末端到3’末端依次包括DNA片段c和DNA片段d；所述DNA片段d和所述DNA片段4的5’末端完全一致；
所述测序引物甲从5’末端到3’末端依次包括DNA片段X和DNA片段Y；所述DNA片段X与所述DNA片段c反向互补，所述DNA片段Y与所述DNA片段a完全一致；
所述测序引物乙与所述DNA片段4序列反向互补。


2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：
所述DNA片段1和所述DNA片段4均为20-35个核苷酸组成的单链DNA分子；
所述DNA片段2和所述DNA片段5均为5-9个核苷酸组成的单链DNA分子；
所述DNA片段3和所述DNA片段6均为5-11个核苷酸组成的单链DNA分子；
所述DNA片段a为15-30个核苷酸组成的单链DNA分子；
所述DNA片段c为15-30个核苷酸组成的单链DNA分子。


3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：
所述单链DNA分子甲为30-50个核苷酸组成的单链DNA分子；
所述单链DNA分子乙为30-50个核苷酸组成的单链DNA分子；
所述建库PCR上游引物为45-50个核苷酸组成的单链DNA分子；
所述建库PCR下游引物为45-50个核苷酸组成的单链DNA分子；
所述测序引物甲为40-50个核苷酸组成的单链DNA分子。


4.如权利要求1至3任一所述的试剂盒，其特征在于：所述建库PCR下游引物还包括Barcode标记序列；所述Barcode标记序列位于所述DNA片段c的下游、所述DNA片段d的上游。


5.如权利要求1至4任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括用于检测DNA标准品的试剂；所述用于检测DNA标准品的试剂包括DNA标准品、建库PCR上游引物-标准品和建库PCR下游引物-标准品；
所述DNA标准品含有特异DNA分子；所述特异DNA分子从5’末端到3’末端依次包括DNA片段m、随机DNA片段和DNA片段n；
所述建库PCR上游引物-标准品从5’末端到3’末端依次包括所述DNA片段a和DNA片段M；所述DNA片段M和所述DNA片段m完全一致；
所述建库PCR下游引物-标准品从5’末端到3’末端依次包括所述DNA片段c和DNA片段N；所述DNA片段N和所述D...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵芳，李舟，章文蔚，刘二凯，张长领，陈奥，
申请(专利权)人：深圳华大生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44