一种柳杉CfCCR基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种柳杉CfCCR基因及其应用，属于植物分子生物学和基因工程技术领域。本发明专利技术的柳杉木质素合成调控CfCCR基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。CfCCR基因是木质素合成特异途径的关键限速酶，通过编码蛋白调节植物中合成木质素的相关基因表达，对于木质素的生物合成以及抗逆具有重要的作用。转CfCCR基因的烟草，木质素表达增多，细胞壁发达。因此，可以通过表达CfCCR基因改变柳杉或其它植物茎中木质部细胞壁厚度，从而增加木材密度，提高木材的品质和质量以及植物抗逆性。

Cfccr gene of Cryptomeria fortunei and its application

【技术实现步骤摘要】
一种柳杉CfCCR基因及其应用
本专利技术属于植物分子生物学和基因工程
，具体涉及一种柳杉CfCCR基因及其应用
技术介绍
柳杉(Cryptomeriafortunei)属于杉科(Taxodiaceae)柳杉属(CryptomeriaD.Don)植物，又名长叶孔雀松，乔木，树冠圆锥形；树皮红棕色，纤维状，大枝近轮生，小枝细长，常下垂，叶钻形略内向弯曲，先端内曲，四边有气孔线，为我国特有树种，是重要的用材树种，其木材利用价值广泛，也可作为观赏植物和药用。柳杉木质化程度会影响柳杉木材密度大小，从而影响木材的质量。CCR在木质素合成的特异途径中起关键作用，是该途径的第一个关键酶，催化肉桂酰CoA脂形成相应的肉桂醛，研究认为CCR影响木质素单体的合成。前人研究发现：抑制CCR活性降低的越快，则相应的木质素含量降低的就越多，对植物的生长发育造成影响。抑制CCR活性会使木质素含量降低，次生壁沉积减少，次生壁结构松弛，严重者会使植株发育不正常。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术所要解决的技术问题在于提出一种柳杉CfCCR基因，该基因在木质素合成的特异途径中有关键作用，可以促进植物木质素合成基因的表达，从而增强木质素的生物合成，使木质素含量和细胞壁厚度增加，增加柳杉木材密度，提高木材的品质和质量。本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供所述柳杉CfCCR基因的应用。为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案如下：一种柳杉CfCCR基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。所述的柳杉CfCCR基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。含有所述的柳杉CfCCR基因的载体、重组菌或宿主细胞。进一步地，所述的载体为植物重组表达载体。进一步地，所述的植物重组表达载体为pBI121+CfCCR。进一步地，所述的宿主细胞为农杆菌EHA105。所述的柳杉CfCCR基因在促进植物木质素合成、细胞壁发育或抗逆性中的应用。进一步地，所述的应用，包括以下步骤：1)构建柳杉CfCCR基因的载体；2)将所构建的柳杉CfCCR基因的载体转化到植物或植物细胞中；3)培育筛选得到木质素增多、细胞壁发育增强或抗逆性提高的植株。进一步地，所述的应用中，所述的植物为柳杉或烟草。有益效果：相比于现有技术，本专利技术的优点为：本专利技术提供的柳杉CfCCR基因是木质素合成特异途径的关键限速酶，通过编码蛋白调节植物中合成木质素的相关基因表达，对于木质素的生物合成以及提高植物抗逆性具有重要的作用。转CfCCR基因的烟草，木质素表达增多，细胞壁发达。可以通过过表达CfCCR基因改变柳杉或其它植物茎中木质部细胞壁厚度，从而增加木材密度，提高木材的品质和质量以及植物抗逆性，因而该基因具有重要应用价值和意义。附图说明图1为本专利技术的CfCCR基因表达载体pBI121图谱图；图2为本专利技术的Cf℃CR基因不同发育阶段相对表达量示意图；图3为本专利技术的CfCCR基因表达烟草生长过程结果图；图4为本专利技术的CfCCR基因表达烟草成熟后表型对比结果图，图中左侧为WT，右侧为CfCCR烟草；图5为本专利技术的CfCCR基因表达烟草茎横切面观察结果图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进一步进行描述。下述实施例中所使用的方法如无特别说明均为常规方法，本实验所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成，测序均由南京金斯瑞生物技术公司完成。实施例1：一、柳杉CfCCR基因的克隆和表达分析1、柳杉CfCCR基因的克隆选取南京林业大学树木园里生长良好的柳杉，去除表皮后用刀片刮取维管组织，提取总RNA并反转录成cDNA。根据杉木CCR基因保守序列分析数据，及本实验室柳杉转录组高通量测序数据分析的差异表达基因，利用NCBI在线工具Blast比对筛选出一条CCR的同源序列，进行引物设计。设计特异性扩增引物CCR-F和CCR-R，以cDNA为模板进行PCR扩增，PCR产物的回收，连接pBI121载体(图1)。所述特异性扩增引物CCR-F和CCR-R为：CCR-F：5′-TAATTGTTGTAAATACGCTTG-3′CCR-R：5′-AATTACAGTTCTTATTGGCAT-3′以反转录合成的cDNA为模板，利用引物CCR-F和CCR-R进行扩增。反应体系(50μL)为：25.0μLMaxDNAPolymerase，1.0μlcDNA，22.0μLddH2O，1.0μLForwardPrimer(10μM)，1.0μLReversePrimer(10μM)。扩增反应程序为：98℃1min；98℃10s，55℃10s，72℃25s，35个循环；72℃5min；4℃∞。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测后，对目的片段进行回收，并连接到载体pBI121上，然后转移到大肠杆菌感受态细胞，阳性克隆检测后送至南京金斯瑞生物公司测序。测序完成后利用测序得到的3′、5′端及中间片段序列拼接得到CfCCR基因，之后利用DNAMAN软件进行比对，确保所获得的序列为目的序列。结果表明，所获CfCCR基因其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，大小为975bp，所编码的蛋白质的氨基酸序列和SEQIDNO.2所示，大小为324aa。2、柳杉CfCCR基因实时荧光定量表达分析选择Actin为内参基因，根据CfCCR基因的核苷酸序列SEQIDNO.1信息利用Oligo7设计CfCCR的实时定量引物。RT-CCR-F：5′-GCTTGCCCTGTTGTAGTACCAA-3′RT-CCR-R：5′-TCTGCATACTTCCACGCCTC-3′实时荧光定量PCR反应体系(20μL)：10.0μLTBGreenPremixExTaqII(TliRnaseHPlus)(2×)，0.8μLPrimer-F(10μM)，0.8μLPrimer-R(10μM)，0.4μLROXReferenceDye(50×)，2.0μLDNA模板，6.0μLddH2O。PCR扩增程序为：95℃30s；95℃5s，55℃30s，72℃30s，45个循环；95℃15s；60℃lmin；95℃15s；4℃∞。荧光定量的结果(图2)显示：柳杉CfCCR基因在5个生长发育阶段总体呈现先降后升的趋势，在11月达到最高值，推测是因为CCR基因在木质素合成特异途径中起到限速作用，直接影响木质化的情况，前人在研究CCR基因时，发现木质化对植物具有保护作用，可以干扰病菌进入植物体内，推测柳杉CCR基因在影响木质化时，也具有抗逆性的作用。二、pBI121表达载体和宿主细胞的构建根据已经成功克隆的目的基因CfCCR序列，使用双酶切法使pBI121载体线性化，降低转化背景，减少假阳性克隆。根据已经扩增得到的CfCCR基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种柳杉CfCCR基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所不。/n

【技术特征摘要】
1.一种柳杉CfCCR基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所不。


2.权利要求1所述的柳杉CfCCR基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。


3.含有权利要求1所述的柳杉CfCCR基因的载体、重组菌或宿主细胞。


4.根据权利要求3所述的柳杉CfCCR基因的载体，其特征在于，所述的载体为植物重组表达载体。


5.根据权利要求4所述的柳杉CfCCR基因的载体，其特征在于，所述的植物重组表达载体为pBI121+CfCCR。


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【专利技术属性】
技术研发人员：徐进，华慧，胡海亮，郭臻昊，杨俊杰，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32