石蒜属植物荧光EST-SSR分子标记及其应用制造技术

本发明专利技术涉及石蒜属植物荧光EST‑SSR分子标记及其应用，属于分子标记技术领域。本发明专利技术所述分子标记包括QZ209、QZ155、QZ175和QZ171。本发明专利技术所述分子标记QZ209、QZ155、QQZ175、QZ171能够将16个石蒜种完全区分，其中，QZ209的引物的多态位点数达12个，PIC值为0.92，单独应用就可以区分12个石蒜不同种材料，可作为一个十分优良的SSR分子标记，应用于以后的石蒜种分类鉴定工作，为石蒜属资源的保护开发提供科学依据。

Fluorescent EST-SSR molecular marker of Lycoris and its application

【技术实现步骤摘要】
石蒜属植物荧光EST-SSR分子标记及其应用
本专利技术涉及分子标记
，具体涉及石蒜属植物荧光EST-SSR分子标记及其应用。
技术介绍
石蒜属(Lycorisspp.)是原产我国的重要的药用和观赏植物，其花色、花型多变，观赏性强，且鳞茎中含有石蒜碱、加兰他敏等多种生物碱，具有治疗重症肌无力、老年痴呆症(阿尔茨海默症Alzheimer’sdisease,AD)，抗肿瘤和抗癌等重要作用，经济价值极高。石蒜属植物的花和叶具有很高的观赏价值，易产生变异，种间杂交亲和性高，杂交后代表型多变，形态和色彩变异丰富，由于石蒜属植物种植后需3-5年的时间才能形成一个开花球，仅凭叶片，鳞茎和花的外观形状，颜色和大小进行品种鉴定及分类会出现误差，在销售和生产中易出现混淆现象。因此，需要对石蒜属植物的品种进行早期鉴定。传统的标记如同工酶、RFLP、RAPD、AFLP等标记技术难以在石蒜属植物育种中提供大量有效的遗传信息，不利于石蒜属植物基因的发掘与利用。基因组SSR标记(gSSR)开发技术的费时费力且成本高等缺点，EST-SSR标记是基于转录组测序的标记，覆盖率高、分布随机、变异广泛、重复性好、不需大量的基因组测序，开发成本降低，引物在物种之间具有的通用性好，位点特异性高，EST作为基因转录本的一部分，更易获得基因表达的信息，可为功能基因的直接鉴定提供重要依据。将荧光标记应用于EST-SSR分子标记系统，是对现有SSR系统的极大优化，基于毛细管电泳技术的自动荧光检测比银染检测法能更大量、快速、精确的区分相差微小的碱基的片段，数据处理的自动化程度高，更加适用于大规模不同种质的鉴定分类工作。毛细管电泳检测后，能区分小至2bp的差异，并提供准确的谱带信息，这是常规银染或者琼脂糖凝聚检测所不能达到的，EST-SSR荧光标记在大量样本、快速、准确鉴定分析方面具有很大优越性。目前，已相继在葡萄、大豆、蓝莓和小麦等物种均已开展了EST-SSR标记的研究。与这些物种相比，石蒜属EST-SSR标记开发滞后，目前仅利用少量石蒜EST序列开发了个别SSR引物，标记数量不足，且引物的扩增结果多为染色跑胶获得，没有精确的谱带大小信息，不适用于大量准确的资源分析鉴定。限制了石蒜的资源鉴定和分子遗传学研究。因此，迫切需要获取更多的EST-SSR标记，并对石蒜属资源遗传多样性和系谱认证等方面的精准研究和应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供石蒜属植物荧光EST-SSR分子标记及其应用。本专利技术开发了石蒜属的荧光EST-SSR分子标记，提供多态性引物，建立石蒜EST-SSR标记开发和毛细管电泳检测的技术体系，构建指纹图谱数据库，为石蒜属的遗传背景分析和大量、精确鉴定提供更多新的标记，弥补目前石蒜属内EST-SSR标记缺乏的不足。本专利技术提供了一种石蒜属植物荧光EST-SSR分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，编号为QZ209。本专利技术还提供了用于扩增上述技术方案所述的分子标记的引物，所述引物为如SEQIDNO.5所示核苷酸序列5’端标记HEX的正向引物QZ209F和如SEQIDNO.6所示核苷酸序列的反向引物QZ209R。本专利技术还提供了一组石蒜属植物荧光EST-SSR分子标记，所述分子标记包括QZ209、QZ155、QZ175和QZ171；所述QZ209的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述QZ155的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述QZ175的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述QZ171的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。本专利技术还提供了用于扩增上述技术方案所述的分子标记的引物，所述引物包括：如SEQIDNO.5所示核苷酸序列5’端标记HEX的正向引物QZ209F和如SEQIDNO.6所示核苷酸序列的反向引物QZ209R。如SEQIDNO.7所示核苷酸序列5’端标记HEX的正向引物QZ155F和如SEQIDNO.8所示核苷酸序列的反向引物QZ155R。如SEQIDNO.9所示核苷酸序列5’端标记FAX的正向引物QZ175F和如SEQIDNO.10所示核苷酸序列的反向引物QZ175R。和如SEQIDNO.11所示核苷酸序列5’端标记HEX的正向引物QZ171F和如SEQIDNO.12所示核苷酸序列的反向引物QZ171R。本专利技术还提供了上述技术方案所述分子标记或上述技术方案所述引物在鉴别石蒜种中的应用。优选的是，所述石蒜种为12个，包括长筒石蒜、黄长筒石蒜、中国石蒜、石蒜、玫瑰石蒜、红蓝石蒜、湖北石蒜、乳白石蒜、陕西石蒜、换锦花、香石蒜和短蕊石蒜。本专利技术还提供了上述技术方案所述分子标记或上述技术方案所述引物在鉴别石蒜种中的应用。优选的是，所述石蒜种为16个，包括长筒石蒜、黄长筒石蒜、忽地笑、中国石蒜、石蒜、玫瑰石蒜、红蓝石蒜、湖北石蒜、稻草石蒜、粉稻草石蒜、乳白石蒜、陕西石蒜、换锦花、鹿葱、香石蒜和短蕊石蒜。优选的是，所述鉴别的PCR反应体系每25μL包括：基因组DNA1～5μL，3～4pmol正向引物和反向引物各0.5μL，10mMdNTP0.5μL，10×PCRBuffer2.5μL，25mMMgCl22μL，5UμL-1Taq酶0.2μL，加ddH2O补足25μL；PCR程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，55～60℃退火30s，72℃延伸30s，10个循环；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，10个循环；72℃延伸6min，4℃保存。优选的是，所述PCR反应后，还包括采用毛细管电泳法进行荧光检测。本专利技术提供了石蒜属植物荧光EST-SSR分子标记。本专利技术对换锦花，石蒜，中国石蒜，忽地笑，长筒石蒜和香石蒜进行转录测序拼接后得到404481条Unigene，利用perl脚本MISA软件对Unigene中的SSR位点进行分析，设计并合成了30对EST-SSR引物并进行荧光标记，经过PCR扩增、毛细管电泳检测，最终筛选出4个具有高多态性的荧光EST-SSR分子标记。1、经16个石蒜属不同种(变种)资源的筛选，验证了这4个具有多态性的通用型标记，构建了石蒜属核心指纹图谱数据库，为资源的分类鉴定和遗传研究奠定基础。2、本专利技术将荧光标记应用于EST-SSR分子标记系统，是对现有SSR系统的极大优化，基于毛细管电泳技术的自动荧光检测比银染检测法能更大量、快速、精确的区分相差微小的碱基的片段，数据处理的自动化程度高，更加适用于大规模不同种质的鉴定分类工作。毛细管电泳检测后，能区分小至2bp的差异，这是常规银染检测所不能达到的，EST-SSR荧光标记在大量样本、快速、准确鉴定分析方面的优越性。3、石蒜种质利用EST-SSR荧光标记分析系统，能够构建16个石蒜种的指纹图谱。QZ209、QZ155、QQZ175、QZ171这4对引物组合就可以将16份材料完全区分。引物QZ209的多态位点数达12个，PIC值为0.92，是供试引物中最大，单独应用就可以区分12个石蒜不同种材料，可作为一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种石蒜属植物荧光EST-SSR分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编号为QZ209。/n

【技术特征摘要】
1.一种石蒜属植物荧光EST-SSR分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，编号为QZ209。


2.用于扩增权利要求1所述的分子标记的引物，其特征在于，所述引物为如SEQIDNO.5所示核苷酸序列5’端标记HEX的正向引物QZ209F和如SEQIDNO.6所示核苷酸序列的反向引物QZ209R。


3.一组石蒜属植物荧光EST-SSR分子标记，其特征在于，所述分子标记包括QZ209、QZ155、QZ175和QZ171；所述QZ209的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述QZ155的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述QZ175的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述QZ171的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。


4.用于扩增权利要求3所述的分子标记的引物，其特征在于，所述引物包括：
如SEQIDNO.5所示核苷酸序列5’端标记HEX的正向引物QZ209F和如SEQIDNO.6所示核苷酸序列的反向引物QZ209R。
如SEQIDNO.7所示核苷酸序列5’端标记HEX的正向引物QZ155F和如SEQIDNO.8所示核苷酸序列的反向引物QZ155R。
如SEQIDNO.9所示核苷酸序列5’端标记FAX的正向引物QZ175F和如SEQIDNO.10所示核苷酸序列的反向引物QZ175R。
和如SEQIDNO.11所示核苷酸序列5’端标记HEX的正向引物QZ171F和如SEQIDNO.12...

【专利技术属性】
技术研发人员：李青竹，蔡友铭，张永春，杨柳燕，许俊旭，孙翊，李心，周晓慧，王桢，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：上海;31