基于引入额外碱基错配的阻滞物进行阻滞取代扩增富集检测目标突变的方法技术

本发明专利技术涉及一种对目标区域基因突变进行富集和检测的方法。该富集方法包括：将含有待检测目标区域的核酸样本和第一引物、第二引物、阻滞扩增序列混合，进行第一PCR扩增获得第一扩增产物；基于第一扩增产物利用第一引物和第二引物进行第二PCR扩增获得第二扩增产物；阻滞扩增序列的3’末端含有阻滞基团，阻滞扩增序列和第一引物含有部分重叠序列，待检测目标区域位于阻滞扩增序列与核酸样本的匹配区域内，第一引物的3’末端位于待检测目标区域的上游，阻滞扩增序列与核酸样本之间存在至少一个碱基不匹配位点，所述至少一个碱基不匹配位点不同于待检测目标区域位点。由此可以实现对于低频基因突变的高精度检测。

Detection of target mutation based on block substitution amplification and enrichment by introducing extra base mismatch block

【技术实现步骤摘要】
基于引入额外碱基错配的阻滞物进行阻滞取代扩增富集检测目标突变的方法
本专利技术涉及基因测序领域，具体涉及一种对目标区域基因突变进行富集和检测的方法，尤其涉及一种基于引入额外碱基错配的阻滞物进行阻滞取代扩增富集检测目标突变的方法。
技术介绍
随着时代和科技的快速发展，癌症治疗观念正在发生根本性的改变。国际抗癌联盟认为，1/3的癌症是可以预防的，1/3的癌症如能早期诊断是可以治愈的，1/3的癌症可以通过正确治疗减轻痛苦，延长生命。癌症的治疗手段也由经验科学向循证医学、由细胞攻击模式向靶向性治疗模式转变。早期传统的治疗方式为手术切除、化疗和放疗，其中化疗和放疗不能区分肿瘤细胞和正常细胞，对人体伤害较大。肿瘤靶向治疗技术能够在无创或微创条件下以肿瘤为目标，采用有选择、针对性较强、患者易于接受、反应小的局部或全身治疗，最终达到有效控制肿瘤的目的，对人体伤害较小。现代的癌症精准医疗就是在患者确诊癌症后进行基因检测来确定基因突变种类，寻找适用于该种突变的靶向治疗药物，最后通过结合患者临床表现来制定正确的靶向治疗方案来治疗癌症。基因检测作为靶向治疗的上游事件，对指导整个靶向治疗方案起到十分重要的作用。起初，我们使用肿瘤组织作为基因检测的材料，但是因为获取肿瘤组织对人体伤害较大，部分患者的状况不适宜获取肿瘤组织等原因，我们使用血液作为替代的基因检测材料。1948年，人们首次发现人体血液中存在游离DNA(cfDNA)，这是一种以单链或双链DNA或DNA蛋白复合物形式存在于血液、脑脊液中的一种胞外DNA。在肿瘤患者体内，由肿瘤细胞坏死、凋亡后释放入血液中的游离DNA片段称为循环肿瘤DNA(ctDNA)。ctDNA片段大小一般为160-180bp左右，半衰期为16min-2h不等。由于ctDNA携带了肿瘤细胞的全部变异信息，且这些基因突变仅存在于癌前细胞或癌细胞基因组中，不会在同一机体的其他正常细胞DNA中出现，因此，ctDNA相对于传统的组织学样本能够更好的体现肿瘤异质性。此外，ctDNA无需侵入性取材，只需取一管血即可检测，能够方便地监测肿瘤进程、监测靶向治疗动态。因此，基于ctDNA的肿瘤基因检测技术逐渐成为临床应用的热点，具有广泛前景。目前，市面上的许多的ctDNA检测技术，包括NGS检测技术、基于Arms原理的qPCR检测技术以及数字PCR等。其中NGS检测最为广泛。ctDNA检测除了在指导靶向治疗上起到重要作用，在癌症的术后监控以及癌症的早期筛查方便也具有巨大的潜力，但要将其广泛应用于临床还需克服诸多障碍。首先，血液中游离DNA含量很少，平均1ml血浆中只能提取到约10ng左右总游离DNA，ctDNA占总游离DNA只有0.1％-10％，而在癌症术后病人和早期癌症病人的血液中ctDNA占比还要更低的多。所以，目前急需一种既能完成低频突变位点检测又能达到一定通量的ctDNA检测技术，市面上主要存在的这几种ctDNA检测技术均不能满足要求。这种一定通量的低频突变位点检测是目前ctDNA检测技术遇到的一个瓶颈。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种对目标区域基因突变进行富集和检测的方法，该方法通过引入额外碱基错配的阻滞物进行阻滞取代扩增，达到富集检测目标突变的目的。现在市面存在的一些ctDNA检测方法，都不太能满足癌症术后监控和癌症早期筛查的需求。NGS检测虽然通量高，但检测灵敏度不太高；数字PCR检测虽然检测灵敏度很高，但通量较差，一次只能检测一个突变位点；基于ARMS原理的qPCR检测的突变类型比较有限，灵敏度和通量都不算太高。2017年报道的一种名为“阻滞取代扩增”的PCR技术(BlockerDisplacementAmplification，BDA)，能够达到<0.1％突变频率样本的检测要求，并能同时完成156种突变序列的检测。BDA方法通过加入不同的阻滞扩增序列能够同时将多种不同的低频突变DNA序列富集到一个较高的频率，最后通过一代测序技术对富集后的DNA序列进行测序。BDA方法不仅能够检测ctDNA中的低频突变DNA，还因其依托于一代测序技术使其能达到极高的检测准确性，这种兼顾了检测的高灵敏度、高准确度以及一定通量的检测方法非常适用于癌症术后监控和癌症早期筛查。而且，与NGS检测和基于ARMS原理的qPCR检测方法相比，BDA检测方法拥有较高灵敏度和准确度，其依托于一代测序，而一代测序一直是测序的金标准，可以达到99.9％的准确度。可以将其用于癌症的术后监控和癌症的早期筛查。然而专利技术人在研究过程中发现BDA方法也存在着较为严重的缺陷，例如在对阳性样本和阴性样本进行富集检测时发现原本的序列在富集扩增过程中出现了一两个碱基错误，并且这种序列扩增的错误不能通过增加酶的保真性得以解决。出现这种序列扩增错误可能是阻滞取代扩增体系的不稳定性导致的。发生扩增错误的碱基位置存在于待扩增序列与特异性阻滞扩增序列碱基互补的区域内，但不是固定发生在某个碱基位置。有时发生在待检测碱基位点附近，有时正好发生在待检测位点上。这对后续正确检测造成了十分重要的影响，如果不能解决这个问题，将不能保证BDA方法检测的准确性。本专利技术着重于解决在BDA方法检测中出现的上述扩增序列错误的问题，在保证较高灵敏度的同时提高该方法的准确度，为推动该方法实现临床应用提供一些帮助。专利技术人研究发现，无论是改变PCR酶、PCR的退火延伸温度、引物与阻滞扩增序列的比例等因素均不能从根本上解决BDA方法检测中出现的扩增序列错误的问题。专利技术人通过研究发现，以对阻滞扩增序列进行改造，可以完美的解决这个问题，既保证了该方法对于低频突变的检测能力，又解决了样本检测中出现的碱基突变的问题。这种优化的阻滞扩增序列是在原有的阻滞扩增序列基础上人为的引入一个或多个碱基的突变(与待检测目标区域位点碱基互补位点除外)，这样的阻滞扩增序列无论是与野生型核酸样本，还是和突变型核酸样本均不能够完全碱基互补，但阻滞扩增序列与野生型核酸样本的结合力仍然大于与突变型核酸样本的结合力。具体而言，本专利技术提供了如下技术方案：在本专利技术的第一方面，本专利技术提供了一种对目标区域基因突变进行富集的方法，包括：(1)将含有待检测目标区域的核酸样本和第一引物、第二引物、阻滞扩增序列混合，进行第一PCR扩增，以便获得第一扩增产物；(2)基于所述第一扩增产物，利用所述第一引物和第三引物进行第二PCR扩增，以便获得第二扩增产物；其中，所述阻滞扩增序列的3’末端含有阻滞基团，所述阻滞扩增序列和所述第一引物含有部分重叠序列，所述待检测目标区域位于所述阻滞扩增序列与所述核酸样本的匹配区域内，所述第一引物的3’末端位于所述待检测目标区域的上游，所述阻滞扩增序列与所述核酸样本之间存在至少一个碱基不匹配位点，所述至少一个碱基不匹配位点不同于所述待检测目标区域的位点。本专利技术所提供的对目标区域基因突变进行富集的方法，其优化了阻滞取代扩增的PCR技术，在对含有待检测目标区域的核酸样本进行扩增时，加入第一引物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种对目标区域基因突变进行富集的方法，其特征在于，包括：/n(1)将含有待检测目标区域的核酸样本和第一引物、第二引物、阻滞扩增序列混合，进行第一PCR扩增，以便获得第一扩增产物；/n(2)基于所述第一扩增产物，利用所述第一引物和第三引物进行第二PCR扩增，以便获得第二扩增产物；/n其中，所述阻滞扩增序列的3’末端含有阻滞基团，所述阻滞扩增序列和所述第一引物含有部分重叠序列，/n所述待检测目标区域位于所述阻滞扩增序列与所述核酸样本的匹配区域内，所述第一引物的3’末端位于所述待检测目标区域的上游，/n所述阻滞扩增序列与所述核酸样本之间存在至少一个碱基不匹配位点，所述至少一个碱基不匹配位点不同于所述待检测目标区域位点。/n

【技术特征摘要】
1.一种对目标区域基因突变进行富集的方法，其特征在于，包括：
(1)将含有待检测目标区域的核酸样本和第一引物、第二引物、阻滞扩增序列混合，进行第一PCR扩增，以便获得第一扩增产物；
(2)基于所述第一扩增产物，利用所述第一引物和第三引物进行第二PCR扩增，以便获得第二扩增产物；
其中，所述阻滞扩增序列的3’末端含有阻滞基团，所述阻滞扩增序列和所述第一引物含有部分重叠序列，
所述待检测目标区域位于所述阻滞扩增序列与所述核酸样本的匹配区域内，所述第一引物的3’末端位于所述待检测目标区域的上游，
所述阻滞扩增序列与所述核酸样本之间存在至少一个碱基不匹配位点，所述至少一个碱基不匹配位点不同于所述待检测目标区域位点。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阻滞扩增序列与所述核酸样本之间存在2～5个碱基不匹配位点，优选存在2～3个碱基不匹配位点；
任选地，所述至少一个碱基不匹配位点的碱基类型为由C/G碱基突变为A/T碱基。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阻滞扩增序列的Tm值高于所述第一引物的Tm值；
优选地，所述阻滞扩增序列的Tm值为60摄氏度～70摄氏度，优选为60摄氏度，所述第一引物的Tm值为55摄氏度～60摄氏度。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阻滞扩增序列去除所述部分重叠序列后序列的Tm值高于所述第一引物去除所述部分重叠序列后序列的Tm值。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阻滞基团包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：濮悦，王倩雯，王涛，
申请(专利权)人：杭州瑞普基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33