一种用于白血病高通量药物筛查的方法技术

本发明专利技术提供了一种用于白血病高通量药物筛查的方法，步骤如下：血液肿瘤干细胞的分离提取鉴定培养：进行骨髓样本的采集；进行单个核细胞的分离；通过免疫磁珠法分离白血病干细胞群；将磁珠分离纯化后细胞进行传代培养；建立药物库：根据药物说明书及药物动力学，选择药物浓度，同血液肿瘤干细胞混合培养，分析药物对血液肿瘤干细胞的抑制作用。本发明专利技术高通量药物筛查方法可以针对患者个性化精准的给出合适的治疗方案意见，为复发难治性患者争取宝贵的治疗时机，减少试药风险，最大程度的增加药物疗效和减少药物副作用，同时可以做药物组合，针对临床常用化疗药物组合做一个综合评分，为医生在为患者制定临床联合用药方面提供参考。

A high throughput drug screening method for leukemia

【技术实现步骤摘要】
一种用于白血病高通量药物筛查的方法
本专利技术涉及一种用于白血病高通量药物筛查的方法。
技术介绍
JohnDick在急性粒细胞白血病(AML)患者中分离纯化了CD34+/CD38-表型的AML细胞，将这类细胞接种于NOD/SCID小鼠，可以产生类似人类的白血病，而CD34-/CD38+表型的白血病细胞却不易形成肿瘤，因此推测CD34+/CD38-表型白血病细胞是AML干细胞。进入21世纪后，人们在实体瘤(最早是在乳腺癌和脑瘤)中同样分离和验证了癌干细胞，彻底宣告了癌干细胞时代的到来。肿瘤干细胞是指具有干细胞特性的肿瘤细胞，具有“自我更新”和“多向分化”的能力，通常这类的细胞被认为有形成肿瘤，发展成癌症的潜力，特别是随着癌症转移出去后，产生新型癌症的来源，是肿瘤复发的种子。在功能实验中被定义为当移植进免疫缺陷小鼠体内时能形成肿瘤和自我更新的细胞。有研究表明：把小鼠白血病细胞移植到同品系的小鼠体内，发现移植细胞仅仅有1％-4％能够形成脾脏内克隆，这说明，只有部分肿瘤细胞具有致瘤性。在白血病中，仅有万分之一的细胞具有这种无限增值的潜能，但是它们数量虽少，但具有干细胞的特征，可能是唯一保持增值的肿瘤细胞，这种细胞称为肿瘤干细胞。肿瘤细胞是一种变异的细胞，是产生癌症的病原，这些细胞也可以持续增值分化，形成相对成熟的肿瘤细胞，他们不能再增值，不能形成细胞集落，或者肿瘤细胞仅能够分裂几次，体外克隆培养只能形成几个或者几十个细胞经短暂的分化最终死亡，而其中的肿瘤干细胞才能够持续的增值，形成细胞集落，它们对肿瘤的形成和生长过程中起决定性作用，这一小部分具有干细胞性质的肿瘤干细胞，具有无限的自我更新、多向分化潜能与高度增值能力，能够产生不同表型的肿瘤细胞，并赋予肿瘤异质性、增值、浸润、转移等特性。在癌症治疗基础研究中，关于癌症的起源研究是攻克癌症的理论基石。克隆演化学说与癌干细胞学说是解释癌症起源的两大主线。克隆演化学说强调细胞随机获得累积突变而具备持久增殖的能力，而癌干细胞学说强调肿瘤组织内的层级性——只有极少数的原初突变细胞才具有持久的增值能力。不过我们必须认识到，两种学说并非互不相容。克隆演化学说可以是建立在癌干细胞学说基础上的。我们可以说，细胞通过自然选择而具备广泛增殖的能力，这个细胞就成为了癌干细胞。而这种自然选择，可以建立在多种组织生态复杂性因素的任何可能因素之上。克隆演化学说的核心，就是“变化”。癌干细胞的基因型和表型在癌症演进过程中也是不断变化的，它唯一不变的特征就是广泛的自我更新能力。很多治疗方案只是给癌干细胞提供了另一种生存和增殖的方向。所以，我们一方面相信癌干细胞学说在解释癌症起源问题上的合理性，另一方面也要意识到，癌干细胞具有复杂的基因多样性，这在治疗方案的选择上尤其需要注意。大量研究表明，白血病患者体内存在一群极微量的细胞群，约占所有白血病细胞的0.1％～1％，这些细胞通常对化疗药物不敏感，是导致白血病复发的罪魁祸首。无论在长期的细胞培养中还是动物模型体内它们都能引起并维持白血病，这群白血病细胞被称为白血病干细胞(leukemiastemcells,LSC)。白血病，是一种起源于造血干细胞的血液系统恶性疾病，发病率有逐年上升的趋势。尽管目前的治疗能使大部分患者获得完全缓解，但其疗效至今仍没有取得突破性进展，大约70％的患者仍然会复发。复发的根本原因是LSC的存在。因此，LSC是影响AML患者疗效和获得长期存活的关键因素，有效清除LSC是目前治疗AML的难点和瓶颈。
技术实现思路
要解决的技术问题：本专利技术是基于白血病干细胞肿瘤干细胞理论，通过采集复发难治的血液病患者骨髓，通过实验室分离提取患者肿瘤干细胞并扩增培养，然后将培养的肿瘤干细胞通过药物筛选平台进行药物敏感试验分析，实现个性化精准给药的目的。本专利技术构建了一个包括临床已经上市针对白血病治疗的化疗药物、中药、小分子靶向药物和尚未上市的在研药物的针对血液肿瘤的高通量药物筛选方法。技术方案：一种用于白血病高通量药物筛查的方法，包括以下步骤：步骤1：血液肿瘤干细胞的分离提取鉴定培养：(1)进行骨髓样本的采集；(2)采用骨髓单个核细胞分离液试剂盒进行单个核细胞的分离；(3)通过免疫磁珠法分离白血病CD34+/CD38-干细胞群；(4)将磁珠分离纯化后细胞接种于含20ng/ml表皮细胞生长因子、100u/ml青霉素和100u/ml链霉素、10wt％胎牛血清的DMEM培养基上，37℃、5％CO2培养箱中培养，12h后确定细胞贴壁情况，换液，传代培养；步骤2：建立药物库：根据药物说明书及药物动力学，选择药物浓度，同血液肿瘤干细胞混合培养，分析药物对血液肿瘤干细胞的抑制作用。进一步的，所述步骤1中采用骨髓单个核细胞分离液试剂盒进行单个核细胞的分离的具体步骤为：1)在收集到的骨髓细胞加入适量LF液混匀，以转速500g进行离心20min，弃上清，沉淀以F液重复洗涤两次后用含20wt％胎牛血清的全血及组织稀释液悬起备用；在本专利技术中，LF液为生理盐水，F液为磷酸缓冲液。2)在15mL离心管中加入与骨髓单细胞悬液等量的分离液，分离液≥7mL；3)用吸管小心吸取骨髓单细胞悬液加于分离液液面上，在转速400-500g下离心20-30min；4)离心后，此时离心管中由上至下细胞分四层，第一层为稀释液层，第二层为环状乳白色单个核细胞层，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层，用吸管小心吸取第二层环状乳白色单个核细胞层到另一15mL离心管中，向离心管中加入10mL清洗液，混匀细胞；5)在转速250g下离心10min，弃上清；6)用吸管以5mL-10mL清洗液重悬所的细胞；7)在转速250g下离心10min，弃上清；8)取0.5mL后续实验所需相应液体重悬细胞备用。进一步的，所述步骤1中免疫磁珠法分离白血病CD34+/CD38-干细胞群的具体步骤为：1)CD38-阴性分选：磁性标记，每107总细胞加入800ul缓冲液重悬，加入200ul的生物素抗体，混匀，4℃孵育15min；用缓冲液洗涤细胞，1200rpm/min离心10min，弃上清；加入含200ul生物素抗体的微株缓冲液，混匀，4℃孵育15min；用缓冲液洗涤细胞，1200rpm/min离心10min，弃上清；每107总细胞中加入800ul缓冲液重悬；放入MACS分选仪中，取2ml缓冲液缓慢加入LD型分选柱中，然后将重悬的细胞悬液加入LD型分析柱中，进行阴性选择；收集所有的阴性成分，并计数；2)CD34+阳性分选：磁性标记，200ul缓冲液重悬细胞，加入100ul的阻滞剂，200ulCD34的磁珠，混匀，4℃孵育30min；用缓冲液洗涤细胞，1200rpm/min离心10min，弃上清；每107总细胞加入800ul缓冲液重悬；磁珠分选，放入MACS分选仪中，取2ml缓冲液缓慢加入LD型分选柱中，阴性的细胞成分先行流出，500ul缓冲液加入取空的原标本试管后再加入LD型分选柱中，重复3次后，将LD型分选柱移出分选器，在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于白血病高通量药物筛查的方法，其特征在于：包括以下步骤：/n步骤1：血液肿瘤干细胞的分离提取鉴定培养：(1)进行骨髓样本的采集；(2)采用骨髓单个核细胞分离液试剂盒进行单个核细胞的分离；(3)通过免疫磁珠法分离白血病CD34

【技术特征摘要】
1.一种用于白血病高通量药物筛查的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1：血液肿瘤干细胞的分离提取鉴定培养：(1)进行骨髓样本的采集；(2)采用骨髓单个核细胞分离液试剂盒进行单个核细胞的分离；(3)通过免疫磁珠法分离白血病CD34+/CD38-干细胞群；(4)将磁珠分离纯化后细胞接种于含20ng/ml表皮细胞生长因子、100u/ml青霉素和100u/ml链霉素、10wt％胎牛血清的DMEM培养基上，37℃、5％CO2培养箱中培养，12h后确定细胞贴壁情况，换液，传代培养；
步骤2：建立药物库：根据药物说明书及药物动力学，选择药物浓度，同血液肿瘤干细胞混合培养，分析药物对血液肿瘤干细胞的抑制作用。


2.根据权利要求1所述的一种用于白血病高通量药物筛查的方法，其特征在于：所述步骤1中采用骨髓单个核细胞分离液试剂盒进行单个核细胞的分离的具体步骤为：
1)在收集到的骨髓细胞加入适量LF液混匀，以转速500g进行离心20min，弃上清，沉淀以F液重复洗涤两次后用含20wt％胎牛血清的全血及组织稀释液悬起备用；
2)在15mL离心管中加入与骨髓单细胞悬液等量的分离液，分离液≥7mL；
3)用吸管小心吸取骨髓单细胞悬液加于分离液液面上，在转速400-500g下离心20-30min；
4)离心后，此时离心管中由上至下细胞分四层，第一层为稀释液层，第二层为环状乳白色单个核细胞层，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层，用吸管小心吸取第二层环状乳白色单个核细胞层到另一15mL离心管中，向离心管中加入10mL清洗液，混匀细胞；
5)在转速250g下离心10min，弃上清；
6)用吸管以5mL-10mL清洗液重悬所的细胞；
7)在转速250g下离心10min，弃上清；
8)取0.5mL后续实验所需相应液体重悬细胞备用。


3.根据权利要求1所述的一种用于白血病高通量药物筛查的方法，其特征在于：所述步骤1中免疫磁珠法分离白血病CD34+/CD38-干细胞群的具体步骤为：
1)CD38-阴性分选：磁性标记，每107总细胞加入800ul缓冲液重悬，加入200ul的生物素抗体，混匀，4℃孵育15min；用缓冲液洗涤细胞，12...

【专利技术属性】
技术研发人员：周碧柳，陆益，李均翔，董云加，俞剑锋，沈丽霞，
申请(专利权)人：启迪汉洱康嘉兴生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33