用于重组酶介导的特异性位点的基因叠加的籼稻目标系制造技术

本发明专利技术公开了适于籼稻的重组酶介导的特异性位点的基因叠加的5个起始目标系，每个起始目标系都具有精确的单拷贝转基因DNA，该DNA不影响内源基因、插入位点离最近的基因编码区至少1kb、远离着丝粒、且其报告基因gfp表达良好。该目标体系含有attP、Lox重组位点，有利于将相关功能基因通过位点特异性重组定点叠加在该基因位点处。因此，可减少分离位点，大大降低转基因从实验品系渗入到当地优良品种的育种工作量，另外，商业产品开发者也可将整合到现有的转基因位点上，从而大大降低释放评估费用。

Target lines of indica rice for gene superposition of specific sites mediated by recombinase

【技术实现步骤摘要】
用于重组酶介导的特异性位点的基因叠加的籼稻目标系
本专利技术属于生物
，特别涉及用于重组酶介导的特异性位点的基因叠加的籼稻目标系。
技术介绍
转基因技术，是利用传统的育种方法导入商业品种。但不同品种间的杂交可导致许多重要的农艺性状基因变成杂合状态。对于育种来说，一个育种品系性状必须要纯合，不仅是转基因性状，也包括与大田优良品种相关的所有其他优良性状。对于二倍体和类似二倍体的异源多倍体植物而言，在没有遗传连锁的情况下，通过分离获得n个独立性状的纯合株系的比例是(1/4)n。例如，要获得6个优良性状和1个转基因性状的纯合株系的概率为(1/4)7，但如果再添加3个转基因位点，那么获得纯合株系的比例为(1/4)10，需要在超过1,000,000个单株中才有可能筛选到纯合株系。自然地回交越多，选出只占极少数比例的纯合体就越耗时耗力。对于大量区域性品种的选育及其相应的田间试验而言，增加分离的转基因位点的数量促使转基因作物改良的成本更高，时间更长。为保持单个转基因位点，一些研究学者将新的基因和之前导入的基因体外聚合(重新构建)进行新一轮转化，再通过筛选单拷贝获得植物株系。如果之前导入性状较少，这种“重头来做”的方式值得考虑。但当商业品种已有许多转基因性状时，每增加一个新的性状，重新进行基因工程和重新释放之前的性状会变得更困难。通常，避免多个分离位点的问题可通过直接转化优良品种来解决。这可省去育种过程，也可加速新转基因品种的开发。然而，多数商业品种的遗传转化是很困难的，因此为进行大田评估，需要大量的投入才能获得足够数量的独立转化事件)。更麻烦的是从监管角度而言，即使是同样的DNA的个体转化，不同品种都被认为是不同事件，释放评估要分别进行。而对一个整合事件渗入不同品种情况则被认为是同一个事件。有相关报道，一种在植物体内进行基因叠加的方法，该策略可以将一个新的基因定点整合在已有的转基因位点之后(Houetal.,2014)。整合系统是来自分支杆菌噬菌体Bxb1-att位点特异性整合酶系统。其中，Bxb1整合酶(重组酶)在不含其它蛋白质和高能辅助因子的作用下可以催化48bp的attP位点和38bp的attB位点发生重组，产生attL和attR位点(GhoshP.,KimAl.,HatfullG.F.,2003.TheOrientationofMycobacteriophageBxb1integrationissolelydependentonthecentraldinucleotideofattpandattB.MolecularCell12,1101-1111)。Bxb1整合酶介导定点整合后不需要的DNA可以通过来源于大肠杆菌噬菌体P1中的Cre-lox重组系统删除(Cre蛋白可使同向的34bplox位点间发生重组)。原则上，当每个整合质粒带入下轮整合所需整合位点(attP或attB)时，叠加可持续地进行。为使该基因叠加系统可操作，首先必须要有一个目标植株系(起始系)。该目标系基因组中必须设置一个重组位点(attP或attB序列)(起始位点)，从而允许通过整合酶Bxb1催化此位点进行特异性重组，实现定点整合。同时，为了适宜于整合基因的表达和后续的育种，这个起始位点需要插入到基因组的适宜位置上：(1)报告基因gfp表达良好；(2)单拷贝；(3)非着丝粒近处；(4)没有插入或靠近已知基因；(5)重组位点完整。籼稻是我国主要粮食作物，其基因育种是重要的遗传改良途径。然而其遗传转化普遍困难，通常转化效率在5％左右。起始目标系在籼稻上的建立为后续的基因育种奠定了一个高效的平台。根据现有技术，本专利技术致力于研制一种适用于籼稻基因定点叠加的起始目标系。
技术实现思路
本专利技术的目的在于建立适于籼稻基因定点叠加的起始目标系。本专利技术所采取的技术方案是：将含有重组位点的目标载体通过农杆菌转化转入籼稻中，通过对转化植株进行荧光观测、PCR检测、SouthernBlot和Tail-PCR的一系列筛选，获得了5个适于籼稻基因定点叠加的目标系(起始位点)。每个起始目标株系都具有精确的单拷贝转基因DNA，该DNA不影响内源基因、插入位点离最近的基因编码区至少1kb、远离着丝粒、且其报告基因gus表达良好。本专利技术第一方面，提供了籼稻基因组位点在构建籼稻基因定点叠加起始目标系中的应用，该籼稻基因组位点为：1)籼稻12号染色体的长臂第24,920,581和第24,921,595位碱基之间；2)籼稻11号染色体的短臂第2,871,024和第2,871,043位碱基之间；3)籼稻12号染色体的短臂第10,433,672和第10,433,683位碱基之间；4)籼稻2号染色体的短臂第9,598,791和第9,598,830位碱基之间；5)籼稻2号染色体的长臂第25,994,985和25,995,025位碱基之间；所述籼稻基因组信息参考水稻基因组数据库os-nipponbare-IRGSP-1。本专利技术第二方面，提供了一种建立籼稻起始目标系的方法，包括以下步骤：农杆菌介导法转化含有重组酶位点attP和lox，gfp报告基因表达盒，筛选标记基因nptII表达盒以及RS2重组酶位点的目标载体，并获得转基因植株；检测上述转基因植株T-DNA左右边界，转基因片段在基因组中的插入位点，获得用于目的基因叠加的籼稻起始目标系；构建含有attB、lox重组酶位点和目的基因的叠加载体；将叠加载体和Bxb1重组酶DNA共转化起始目标株系胚性愈伤；获得目的基因定点整合到起始目标系的植株。进一步的，所述attP重组位点为Mycobacteriumsmegmati噬菌体Bxb1重组酶识别的attP重组位点。进一步的，所述attP和attB重组位点能够被Bxb1整合酶识别，将1个或多个目的基因DNA定点整合到籼稻基因组。进一步的，所述lox重组酶位点能够被来源于bacteriophageP1的Cre重组酶识别。进一步的，所述RS2重组位点为Acetinetobacter质粒中能被重组酶CinH识别的RS2重组位点。籼稻基因组中适合上述叠加载体定点整合的籼稻起始目标系，所述起始目标系的基因组位点分别是：1)籼稻12号染色体的长臂第24,920,581和第24,921,595位碱基之间；2)籼稻11号染色体的短臂第2,871,024和第2,871,043位碱基之间；3)籼稻12号染色体的短臂第10,433,672和第10,433,683位碱基之间；4)籼稻2号染色体的短臂第9,598,791和第9,598,830位碱基之间；5)籼稻2号染色体的长臂第25,994,985和25,995,025位碱基之间；基因组信息参考水稻基因组数据库os-nipponbare-IRGSP-1本专利技术的有益效果：1)籼稻遗传转化普遍困难，通常转化效率在5％左右。本专利技术将含有attP、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.籼稻基因组位点在插入籼稻叠加载体中的应用，其特征在于，该籼稻基因组位点为：/n1)籼稻12号染色体的长臂第24,920,581和第24,921,595位碱基之间；/n2)籼稻11号染色体的短臂第2,871,024和第2,871,043位碱基之间；/n3)籼稻12号染色体的短臂第10,433,672和第10,433,683位碱基之间；/n4)籼稻2号染色体的短臂第9,598,791和第9,598,830位碱基之间；/n5)籼稻2号染色体的长臂第25,994,985和25,995,025位碱基之间；/n基因组信息参考水稻基因组数据库os-nipponbare-IRGSP-1。/n

【技术特征摘要】
1.籼稻基因组位点在插入籼稻叠加载体中的应用，其特征在于，该籼稻基因组位点为：
1)籼稻12号染色体的长臂第24,920,581和第24,921,595位碱基之间；
2)籼稻11号染色体的短臂第2,871,024和第2,871,043位碱基之间；
3)籼稻12号染色体的短臂第10,433,672和第10,433,683位碱基之间；
4)籼稻2号染色体的短臂第9,598,791和第9,598,830位碱基之间；
5)籼稻2号染色体的长臂第25,994,985和25,995,025位碱基之间；
基因组信息参考水稻基因组数据库os-nipponbare-IRGSP-1。


2.一种建立籼稻起始目标系的方法，其特征在于，包括以下步骤：
农杆菌介导法转化含有重组酶位点attP和lox，gfp报告基因表达盒，筛选标记基因hpt表达盒以及RS2重组酶位点的目标载体，并获得转基因植株；
检测上述转基因植株T-DNA左右边界，转基因片段在基因组中的插入位点，获得用于目的基因叠加的籼稻起始目标系；
构建含有attB、lox重组酶位点和目的基因的叠加载体；
将叠加载体和Bxb1重组酶DNA共转化起始目标株系胚性愈伤；
获得目的基因定点整合到起始目标系的植株。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述attP重组位点...

【专利技术属性】
技术研发人员：区永祥，李如玉，
申请(专利权)人：中国科学院华南植物园，
类型：发明
国别省市：广东;44