嗜热木糖苷酶的氨基酸突变体及其应用制造技术

嗜热木糖苷酶的氨基酸突变体及其应用。本发明专利技术突变了来源于嗜热网球菌（

Amino acid mutants of pyrolignosidase and their application

【技术实现步骤摘要】
嗜热木糖苷酶的氨基酸突变体及其应用
本专利技术涉及基因工程及生物工程领域，具体涉及嗜热木糖苷酶的氨基酸突变体及其应用。
技术介绍
β-木糖苷酶(β-xylosidase，EC3.2.1.37)是一种木聚糖降解酶系中较为关键的外切糖苷水解酶，能够将非还原性末端的木寡糖和木二糖分解为木糖，通过与木聚糖酶协同作用，已在多个领域中具有广泛应用。在能源工业中，植物纤维原料中的木聚糖可被木聚糖酶系转化成木糖进而转化成乙醇、糠醛等有价值的燃料或化学品；在造纸工业中，β-木糖苷酶与木聚糖酶协同作用可有效提高漂白性能；近年来，β-木糖苷酶已拓展应用到医药行业中，用于水解一些天然化合物(甾体、萜类等苷元与木糖形成的糖苷键)糖基末端的木糖，从而转化成具有重要应用价值的产物。但酶具有专一性，特异性强，不同骨架结构的化合物、即使是同一骨架的化合物，木糖连接的键型不同(如β-1,2-糖苷键，β-1,4-糖苷键)、位置不同，β-木糖苷酶的催化能力、效率差异很大。目前研究比较多、比较深入的是水解木糖基通过β-1,4-糖苷键连接而成的木聚糖。另一方面，在现代产业中，木糖的反馈抑制效应极大地限制了β-木糖苷酶实际应用的效果。因此，通过酶工程技术提升β-木糖苷酶对木糖耐受性至关重要。三七(Panaxnotoginseng)为五加科植物，用于治疗疾病已有悠久历史，是我国传统珍贵药材。迄今为止已有70余种单体皂苷从三七根块、茎叶、花果中分离鉴定。其中，以人参皂苷Rg1和Rb1，三七皂苷R1含量最高。从分子结构上来看，人参皂苷Rg1和三七皂苷R1的主要结构相同，仅仅是三七皂苷R1是在Rg1的6号位的葡糖糖基上通过β-1,2糖苷键连接一个木糖。常见的β-木糖苷酶不具有切断三七皂苷R1结构中6号位上与葡糖糖基连接的β-1,2-木糖苷键生成Rg1的能力。
技术实现思路
解决的技术问题：本专利技术提供了一种嗜热木糖苷酶的氨基酸突变体及其应用。常见的β-木糖苷酶不具有切断三七皂苷R1结构中6号位上与葡糖糖基连接的β-1,2-木糖苷键生成Rg1的能力，而且，酶解过程中对木糖的耐受性差，产生终端产物抑制酶催化活力的问题。另一方面，三七提取物的抗疲劳活性还有待进一步提高，目前还没有一种有效技术。针对现有技术中存在的不足，本专利技术通过基因工程技术，结合信息学技术，通过大量的点的突变改造及筛选，获得能特异性切断三七皂苷R1结构中与葡萄糖糖基连接的β-1,2-木糖苷键的一种新型耐热耐糖β-木糖苷酶突变体HIS284ASP/CYS202LEU；首次建立了高效酶法转化三七皂苷R1制备人参皂苷Rg1的方法。技术方案：来源于嗜热网球菌(Dictyoglomusthermophilum)DSM3960GH39家族的β-木糖苷酶的氨基酸突变体，其特征在于，所述突变位点中有2个，其中HIS284突变为A和D，CYS202突变为L和F。上述突变体的核苷酸序列，如SEQIDNO:4-7所示。上述来源于嗜热网球菌(Dictyoglomusthermophilum)DSM3960GH39家族的β-木糖苷酶的氨基酸突变体H284D/C202L(表示HIS284突变为D，CYS202突变为L)在特异性水解三七皂苷R1生成人参皂苷Rg1中的应用。上述水解条件为：反应温度为25-95℃，pH4.0-7.0，三七皂苷R1底物浓度为0.2～5g/L，加入0.1～2U/mLβ-木糖苷酶反应0.5-12h。优选的水解条件为：反应温度为75℃，pH6.0，三七皂苷R1底物浓度为1g/L，加入1U/mLβ-木糖苷酶反应30min。上述来源于嗜热网球菌(Dictyoglomusthermophilum)DSM3960GH39家族的β-木糖苷酶的氨基酸突变体H284D/C202L在水解三七皂苷R1后的产物在制备抗疲劳产品中的应用。有益效果：1.本专利技术从DictyoglomusthermophilumDSM3960基因组中克隆得到一种耐热β-木糖苷酶基因，与现有技术相比，本专利技术所提供的木糖苷酶具有优良的耐热性能，在75℃、pH6.0的条件下酶活性最高。该酶在温度为70-80℃、pH5.0-7.0的范围内，均具有较高的酶活。该酶具有良好的耐热性能，在75℃下保温2h酶活基本保持不变。该酶适用于70℃以上高温、偏中性条件下的降解，具有潜在的应用价值。2.本专利技术在Xln-DT基础上对其HIS284分别突变为ASP和ALA，其耐糖效率提高了1.35和1.09倍；在HIS284ASP和HIS284ALA基础上对其CYS202分别突变为LEU和PHE，突变体使得该β-木糖苷酶的酶活分别提高了3.28倍和2.97倍。3.本专利技术建立了将三七皂苷R1通过嗜热菌重组β-木糖苷酶的多位点突变体水解的方式转化成人参皂苷Rg1，而且转化效率高，适宜条件下达到100％，且制备的人参皂苷Rg1较转化前的抗疲劳活性有明显的提高。附图说明图1是酶法转化三七皂苷R1生成人参皂苷Rg1示意图；图2是不同来源的β-木糖苷酶对三七皂苷R1转化效率比较示意图；图3是重组酶及突变酶的耐糖系数比较图；图4是重组酶及突变酶的酶活比较图；图5是三七皂苷R1、人参皂苷Rg1标样HPLC谱图；图6是β-木糖苷酶多位点突变体转化三七皂苷R1前后的HPLC谱图；图7是三七皂苷R1和转化后产物人参皂苷Rg1抗疲劳活性对比图，剂量说明：R1-L/Rg1-L：5mg/kg·d；R1-H/Rg1-H：20mg/kg·d。具体实施方式本专利技术提供了一种突变酶转化三七皂苷R1生成人参皂苷Rg1的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步的详细说明。一系列的突变β-木糖苷酶基因，其核苷酸序列如下表所示。突变基因包含上述核苷酸序列的系列重组质粒pET-28a-Xln-DT-284A，pET-28a-Xln-DT-284D，pET-28a-Xln-DT-284A/202L，pET-28a-Xln-DT-284D/202L,pET-28a-Xln-DT-284A/202F，pET-28a-Xln-DT-284D/202F。包含上述SEQIDNO:2-3的重组质粒制备方法，构建步骤为：以实验已经构建的，携带Xln-DT基因的重组质粒pET-28a-Xln-DT为模板，进一步利用反向PCR对Y284A和Y284D进行突变，获得携带有突变基因SEQIDNO:2-3的重组质粒pET-28a-Xln-DT-284A和pET-28a-Xln-DT-284D。包含上本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.来源于嗜热网球菌（

【技术特征摘要】
1.来源于嗜热网球菌（Dictyoglomusthermophilum）DSM3960GH39家族的β-木糖苷酶的氨基酸突变体，其特征在于，所述突变位点中有2个，其中HIS284突变为A和D，CYS202突变为L和F。


2.权利要求1所述突变体的核苷酸序列，其特征在于如SEQIDNO:4-7所示。


3.权利要求1所述来源于嗜热网球菌（Dictyoglomusthermophilum）DSM3960GH39家族的β-木糖苷酶的氨基酸突变体H284D/C202L在特异性水解三七皂苷R1生成人参皂苷Rg1中的应用。


4.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵林果，李琦，李冬冬，童欣怡，蒋玉洁，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32