本发明专利技术公开了一种重组多肽连接酶原及其制备、激活方法与应用。本发明专利技术提供了氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的重组多肽连接酶原，其体外自激活能力获得了显著的提高。本发明专利技术还提供了一种重组多肽连接酶原的制备方法，实现了所述的重组多肽连接酶原的高效可溶表达，所述方法简便高效，原料简单，表达量高，分离纯化易行，易于大量表达，适合工业化生产；本发明专利技术还提供了一种重组多肽连接酶原的激活方法，实现了重组多肽连接酶原的高效激活，激活产物催化效率与环化、连接活性显著；所述的激活产物可用于多肽或蛋白质的环化、多肽与多肽或蛋白质之间的连接、蛋白质与蛋白质之间的连接、蛋白质或多肽与其它化合物的连接中，具有广阔的应用前景。
A recombinant peptide linker and its preparation, activation method and Application
【技术实现步骤摘要】
一种重组多肽连接酶原及其制备、激活方法与应用
本专利技术属于生物
，特别涉及一种重组多肽连接酶原及其制备、激活方法与应用。
技术介绍
生物活性肽具有多种人体代谢和生理调节功能，易消化吸收，有促进免疫、激素调节、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂等作用。与线性多肽相比，环肽不但具有较高的结构稳定性、热稳定性和生物利用度，而且能够抗水解，在化学变性剂条件下能保持完整生物活性，更为重要的是环化能够不同程度地增强多肽原有生理活性。因此，将线性多肽首尾环化成环状一直是国际生物化学与食品药品领域致力解决的关键问题。受制备技术的限制，目前环肽主要用于价格昂贵的药物开发。目前来说，制备环肽的主要方法有：天然环肽分离精制、化学合成及微生物发酵合成。然而，天然产物中环肽含量非常低，分离提纯困难；化学合成需要繁琐的基团保护，降低了反应产率和产品纯度；发酵法则需要特殊菌株，能生产的环肽种类少。相对于上述环肽合成方式，近年来环肽的酶法合成表现出极高的应用前景，还可克服其它制备方法产量和纯度低、副产物产生、分离纯化复杂等缺点。2014年，新加坡学者首次报道了从药用植物蝶豆(Clitoriaternatea)豆荚中分离纯化出特异性天冬酰氨内肽酶Butelase1，发现其能高效催化线性多肽分子内环化，具有底物范围广、识别基序简单、催化速度快等特点。但是，植物提取容易受原料限制，提取工艺耗时长、产率低，耗时3天从1kg豆荚中仅得到的5mg天然Butelase1。因此，通过重组异源表达技术生产和纯化生产活性Butelase1是研究热点。截止目前，在原核表达方面仅有澳大利亚学者AmyM.James通过大肠杆菌异源表达全长氨基酸序列的Butelase1，但其活性远不及天然提取的Butelase1。也有学者尝试利用酵母表达系统重组表达Butelase1，但是，与大肠杆菌原核表达系统相比，真核的酵母表达体系表达量低，表达周期长，分离纯化成本高。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种重组多肽连接酶原；所述的重组多肽连接酶原的体外自激活能力获得了显著的提高。本专利技术的第二目的在于提供一种重组多肽连接酶原的制备方法，实现了所述的重组多肽连接酶原的高效可溶表达。本专利技术的第三目的在于提供一种重组多肽连接酶原的激活方法，所述激活方法获得的重组多肽连接酶原激活产物活性强，催化效率高。本专利技术的第四目的在于提供所述的重组多肽连接酶原或其激活产物的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种重组多肽连接酶原，具有SEQIDNO:1所示氨基酸序列。所述重组多肽连接酶原的氨基酸序列与野生型蝶豆源多肽连接酶原的氨基酸序列SEQIDNO:2相比，具有以下氨基酸突变：338位赖氨酸突变为天冬氨酸；358位脯氨酸突变为天冬酰胺；359位谷氨酸突变为天冬氨酸，将1～20位信号肽截短，以及N末端融合有MBP标签。编码所述的重组多肽连接酶原的DNA分子，具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列。所述的核苷酸序列基于大肠杆菌表达系统对密码子进行了优化，能显著提高异源基因在宿主菌中的表达效率。一种重组表达载体，含有编码所述的重组多肽连接酶原的核苷酸序列。优选的，所述的重组表达载体含有如SEQIDNO:3所示的核苷酸序列。一种重组多肽连接酶原的制备方法，包括如下步骤：将编码所述的重组多肽连接酶原的核苷酸序列克隆入表达载体中构建重组表达载体；再将所述的重组表达载体转化原核表达系统中进行诱导表达，固液分离收集菌体沉淀，纯化后得到所述的重组多肽连接酶原。所述的原核表达系统优选为大肠杆菌表达系统；更优选为大肠杆菌ROSETTA(DE3)。所述的重组表达载体的优选为通过T7启动子进行表达。所述的表达载体优选为含有MBP标签的表达载体，更优选为pMAL-c5x或pMAL-c5x-His，可以极大地增加目的蛋白表达的可溶性。所述的诱导表达的具体操作步骤优选为：将阳性转化体接种于LB培养液进行培养，当菌液OD600达到0.5～0.9时，加入终浓度为0.1～0.6mmol/L的IPTG，15～30℃诱导12～28h；所述的LB培养液中含有卡那霉素30～50μg/mL和氨苄青霉素50～100μg/mL。所述的将阳性转化体接种于LB培养液进行培养的具体操作为：(1)将所述的阳性转化体在LB培养液中于25～40℃振荡培养过夜得到种子液；(2)将种子液接种到LB培养液中，于25～40℃，150～250r/min条件下培养。步骤(2)中所述的接种量优选按与LB培养液的体积比为1:50～1:150进行接种。所述的纯化的步骤优选为：裂解细胞后收集上清液，将上清液过亲和层析柱，洗脱得到纯化后的重组多肽连接酶原。所述的裂解细胞的方法优选为：用超声破碎法冰浴裂解细胞。所述的超声破碎法中，优选将菌体于缓冲液A中重悬后进行；所述的缓冲液A的配方为20mMNaH2PO4-Na2HPO4、200mMNaCl、1mMEDTA、1mMDTT，pH＝7。所述的缓冲液A的用量优选为每克菌体加入10mL缓冲液A。所述的超声破碎法的条件优选为：功率为50～200W，超声1～5s，间隔1～5s，持续2～30min。所述的裂解细胞后收集上清液的操作优选为：裂解后的菌体进行冷冻离心后弃沉淀，过膜，得到所述的上清液。所述的冷冻离心的条件优选在4℃条件下12000r/min离心40min。所述的过膜优选为用0.22μm微孔滤膜过滤。所述的亲和层析柱优选为MBP标签亲和层析柱。所述的洗脱优选为先用缓冲液A平衡，再用缓冲液B洗脱；所述的缓冲液B的配方为：20mMNaH2PO4-Na2HPO4、100mMNaCl、1mMEDTA、10mM麦芽糖，pH＝7。一种重组多肽连接酶原的激活方法，包括如下步骤：将重组多肽连接酶原先在pH为3.5～6的环境下进行第一次透析，再于pH为4.5～7的环境下进行第二次透析，固液分离去除沉淀，得到所述的重组多肽连接酶原激活产物。所述的激活方法优选在25～45℃下进行。所述的第一次透析优选在包含如下组分的缓冲液Ⅰ中进行：20～50mM乙酸-乙酸钠、50～200mMNaCl、1～5mMEDTA、2～5mMDTT。所述的第一次透析的时间优选为8～24h。所述的第二次透析优选在包含如下组分的缓冲液Ⅱ中进行：20～50mMNa2HPO4-NaH2PO4或Na2HPO4-柠檬酸、50～200mMNaCl、1～5mMEDTA、0.5～1mMDTT。所述的第二次透析的时间优选为2～8h。所述的透析优选在透析袋中进行，所述的透析袋优选为截留分子量为3～10kDa的透析袋。一种重组多肽连接酶原激活产物，通过所述的重组多肽连接酶原激活方法得到。所述的重组多肽连接酶原或所述的重组多肽连接酶原激活产物的应用，包括用于多肽或蛋白质的环化、多肽与多肽或蛋白质本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组多肽连接酶原，其特征在于：/n具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列。/n
【技术特征摘要】
1.一种重组多肽连接酶原，其特征在于：
具有SEQIDNO:1所示氨基酸序列。
2.一种DNA分子，其特征在于：
所述的DNA分子编码权利要求1所述的重组多肽连接酶原。
3.一种重组表达载体，其特征在于：
含有编码权利要求1所述的重组多肽连接酶原的核苷酸序列。
4.一种重组多肽连接酶原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将编码权利要求1所述的重组多肽连接酶原的核苷酸序列克隆入表达载体中构建重组表达载体；再将所述的重组表达载体转化原核表达系统中进行诱导表达，固液分离收集菌体沉淀，纯化后得到所述的重组多肽连接酶原。
5.根据权利要求4所述的重组多肽连接酶原的制备方法，其特征在于：
所述的原核表达系统为大肠杆菌表达系统和大肠杆菌ROSETTA(DE3)；
所述的表达载体为含有MBP标签的表达载体和pMAL-c5x或pMAL-c5x-His；
所述的诱导表达的具体操作步骤为：将阳性转化体接种于LB培养液进行培养，当菌液OD600达到0.5～0.9时，加入终浓度为0.1～0.6mmol/L的IPTG，15～30℃诱导12～28h；所述的LB培养液中含有卡那霉素30～50μg/mL和氨苄青霉素50～100μg/mL。
6.一种重组多肽连接酶原的激活方法，其特征在于，包括如下步骤：
将权利要求1所述的重组多肽连接酶原先在pH为3.5～6的环境下进行第一次透析，再于pH为4.5～7的环境下进行第二次透析，固液分离去除沉淀，得到重组多肽连接酶激活产物。
7.根据权利要求6所述的重组多肽连接酶原的激活方法，其特征在于：
所述的激活方法在25～45℃下进行；
所述的第一次透析在包含如下组分的缓冲液Ⅰ中进行：20～50mM乙酸-乙酸钠、50～200mMNaCl、1～5mMEDTA、2～5mMDTT；
所述的第一次透析的时间为...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡松青，樊壬水，侯轶，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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