一种基于人脑胶质瘤原代细胞建立荧光裸鼠肿瘤模型的方法技术

本发明专利技术公开一种基于人脑胶质瘤原代细胞建立荧光裸鼠肿瘤模型的方法，属于医疗领域用动物模型领域，包括以下步骤：S1、稳转细胞培养：采用改良DMEM/F12完全培养基进行细胞培养，大量扩增稳定表达荧光素酶的原代细胞；S2、细胞悬液准备：用改良DMEM/F12完全培养基反复清洗后，收集细胞悬液备用，细胞悬液浓度为6×10

A method of establishing tumor model in nude mice based on primary human glioma cells

【技术实现步骤摘要】
一种基于人脑胶质瘤原代细胞建立荧光裸鼠肿瘤模型的方法
本专利技术属于医疗领域用动物模型领域，更具体的，涉及一种基于人脑胶质瘤原代细胞建立荧光裸鼠肿瘤模型的方法。
技术介绍
脑胶质瘤是来源于胶质细胞及其前身的原发肿瘤，是中枢神经系统最常见而又最难治疗的恶性肿瘤，约占颅内肿瘤的50％。由于大部分胶质瘤呈侵袭性生长，与周围正常脑组织界限不清，手术难以彻底切除肿瘤。基于胶质瘤细胞的生物多样性及发病机制尚未明确的情况，其至今仍是所有恶性肿瘤中接受综合治理预后最差的一类中枢神经系统肿瘤，胶质母细胞瘤患者的平均生存周期仅为14.6个月。如何提高脑胶质瘤的治疗效果已经成为神经外科最富挑战性的难题之一。国内外科研工作者都在广泛开展脑胶质瘤的基础研究，其中动物模型作为研究领域的重要工具也最受广大研究者的青睐。转基因技术及细胞培养技术的发展大力推进了各种基于人类基因异常的大/小鼠胶质瘤模型及基于细胞建立的人脑胶质瘤模型，尤其是原位肿瘤模型的建立。虽然目前此类动物模型较为成熟，但存在一定的不足：1)由于细胞系的易于培养，经济且高效，目前以细胞系如U251和9L建立的肿瘤模型较为常见，如中国专利号CN200610000881.2公开了一种稳定表达萤火虫荧光素酶的9LLUC细胞株的构建与应用，但由于细胞系在体外持续传代，连续传代的细胞系适应了外界培养皿的环境，逐渐丧失了肿瘤的异质性且相关的信号通路等也发生改变，无法准确代表细胞在机体内部的生理变化。2)基于近交系免疫缺陷小鼠建立的可稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)的肿瘤模型虽然可以直观的分辨肿瘤于宿主之间的复杂关系，如中国专利号CN201710452157.1公开了一种建立绿色荧光BALB/c裸小鼠模型的方法及模型应用，但GFP有较强的背景干扰，其敏感性和精确度都大大降低，且培育合适小鼠的周期太长，花费较大、操作复杂。
技术实现思路
基于上述问题，本专利技术提供了一种基于人脑胶质瘤原代细胞建立荧光裸鼠模型的方法。虽然原代细胞相较于细胞系，在体外极难获得与培养，但与胶质瘤细胞系不同，原代细胞分离自新鲜的临床组织，其很好的反应了肿瘤的异质性问题；通过体外质粒转染操作，将荧光素酶质粒转入到原代胶质瘤细胞，通过筛选获得稳定表达荧光素酶的稳转细胞后，再将含有质粒的原代细胞通过微量注射器精准注射到裸鼠脑部的安全部位，接种后7d通过动物活体成像仪观察肿瘤增长情况，操作上方便易行，便于观察肿瘤与宿主动物之间的关系，缩短实验周期，减少花费。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种基于人脑胶质瘤原代细胞建立荧光裸鼠肿瘤模型的方法，包括以下步骤：S1、稳转细胞培养：采用改良DMEM/F12完全培养基进行细胞培养，大量扩增稳定表达荧光素酶的原代细胞；S2、细胞悬液准备：用改良DMEM/F12完全培养基反复清洗后，收集细胞悬液备用，细胞悬液浓度为6×109个细胞/mL，悬液制备后在40min内使用；S3、裸鼠胶质瘤模型建立：取步骤S2的悬液5-8μL缓慢注入小鼠颅内，定期监测裸鼠的后期反应，得到稳定表达荧光素酶的小鼠模型；所述改良DMEM/F12完全培养基为DMEM/F12培养基添加1×NeuroCultSM1NeuronalSupplement。进一步的，步骤S1中，所述细胞培养具体包括以下步骤：P1、将稳定表达荧光素酶的原代细胞接种于改良DMEM/F12完全培养基重悬，于37℃、5％CO2条件下进行培养；P2、培养至细胞丰度达到80％时，用PBS缓冲液漂洗细胞2次，加入1mL消化液消化单层细胞2-3min，所述PBS缓冲液的pH值为pH7.2-7.4；P3、加入2mL改良DMEM/F12完全培养基终止消化，低速离心去上清，收集细胞沉淀，再用1mL改良DMEM/F12完全培养基重悬后补足培养基，按照1传2的比例进行培养，连续传代20代后，备用；所述改良DMEM/F12完全培养基为DMEM/F12培养基添加1×NeuroCultSM1NeuronalSupplement。进一步的，所述改良DMEM/F12完全培养基配方为：DMEM/F12培养基添加1×NeuroCultSM1NeuronalSupplement、10ng/mL人表皮生长因子、10μg/mL人重组胰岛素、100μg/mL肝素、10ng/mL霍乱毒素、1×谷氨酰胺及100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素；所述改良DMEM/F12完全培养基需经过0.22um孔径滤膜过滤后使用。进一步的，步骤P2中，所述消化液为含有1×I型胶原酶和0.25％胰酶-0.2％EDTA的消化液。进一步的，步骤P3中，所述低速离心条件为：1000rpm离心4min。进一步的，步骤S1中，所述稳定表达荧光素酶的原代细胞的构建方法为：步骤S1中，所述稳定表达荧光素酶的原代细胞的构建方法为：体外分离获取人脑胶质瘤原代细胞，传代培养3～5代，将荧光素酶慢病毒表达载体与慢病毒包装质粒混合后，共转染293T细胞，以产生含有萤火虫荧光素酶的慢病毒上清，确定慢病毒的滴度，应用上述慢病毒感染传代培养的原代细胞，经筛选得到稳定表达萤火虫荧光素酶的胶质瘤细胞。其中，稳定表达荧光素酶的原代细胞的筛选方法为常规筛选方法，所述筛选方法较佳的包括以下步骤：向慢病毒感染胶质瘤原代细胞的培养基中加入嘌呤霉素进行稳转细胞的筛选，嘌呤霉素加入量为8μg/mL，每2-3d更换1次含嘌呤霉素的培养基，持续筛选30d，获得稳定表达荧光素酶的原代细胞。进一步的，所述荧光素酶慢病毒表达载体与慢病毒包装质粒分别为：pcDNA3.0-Luc和pLent-U6-GFP-Puro；本专利技术的质粒带有GFP标签，可在荧光显微镜下有效观察转染效率，且带有嘌呤霉素的抗性基因，可用于选项稳转株，且本申请的质粒具有双向接听，便于用于后续研究，包括目的基因的敲低或过表达。由上述方法制备的人脑胶质瘤荧光裸鼠模型，应用于人脑胶质瘤原位移植示踪研究胶质瘤及模拟肿瘤微环境研究。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：1、本专利技术提供一种基于人胶质瘤原代细胞建立荧光裸鼠肿瘤模型的方法，经过改良的细胞培养组合物能够成功地对分离自临床患者的胶质瘤原代细胞和稳定表达荧光素酶的稳转原代细胞进行体外培养，特别是进行原代培养，大大地提高了原代培养的周期和成活率，可以连续培养20代而不丢失异质性，细胞生物特性保持不变、具备正常胶质瘤原代细胞的迁移和侵袭能力，从而得到稳定、不变异的传代原代细胞，克服了现有技术中胶质瘤细胞难以进行原代培养或培养成功率极低的缺陷，以及现有脑胶质瘤细胞最多仅能原代培养10代，导致细胞浓度低难以成功建立肿瘤模型的缺陷，因此对胶质瘤研究具有非常重要的现实意义和实用价值。2、本专利技术采用原位成瘤，脑原位微环境为肿瘤细胞提供了合适的生长环境，有利于原代胶质瘤细胞的原位成瘤，其成瘤率及周期均优于异位成瘤，且载瘤裸鼠生存期稳定，重复性好，有利于进行长期观测，是一种理想的胶质瘤原位移植瘤模型。...

【技术保护点】
1.一种基于人脑胶质瘤原代细胞建立荧光裸鼠肿瘤模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1、稳转细胞培养：采用改良DMEM/F12完全培养基进行细胞培养，大量扩增稳定表达荧光素酶的原代细胞；/nS2、细胞悬液准备：用改良DMEM/F12完全培养基反复清洗后，收集细胞悬液备用，细胞悬液浓度为6×10

【技术特征摘要】
1.一种基于人脑胶质瘤原代细胞建立荧光裸鼠肿瘤模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、稳转细胞培养：采用改良DMEM/F12完全培养基进行细胞培养，大量扩增稳定表达荧光素酶的原代细胞；
S2、细胞悬液准备：用改良DMEM/F12完全培养基反复清洗后，收集细胞悬液备用，细胞悬液浓度为6×109个细胞/mL，悬液制备后在40min内使用；
S3、裸鼠胶质瘤模型建立：取步骤S2的悬液5-8μL缓慢注入小鼠颅内，定期监测裸鼠的后期反应，得到稳定表达荧光素酶的小鼠模型；
所述改良DMEM/F12完全培养基为DMEM/F12培养基添加1×NeuroCultSM1NeuronalSupplement。


2.如权利要求1所述的基于人脑胶质瘤原代细胞建立荧光裸鼠肿瘤模型的方法，其特征在于，步骤S1中，所述细胞培养具体包括以下步骤：
P1、将稳定表达荧光素酶的原代细胞接种于改良DMEM/F12完全培养基重悬，于37℃、5％CO2条件下进行培养；
P2、培养至细胞丰度达到80％时，用PBS缓冲液漂洗细胞2次，加入1mL消化液消化单层细胞2-3min，所述PBS缓冲液的pH值为pH7.2-7.4；
P3、加入2mL改良DMEM/F12完全培养基终止消化，低速离心去上清，收集细胞沉淀，再用1mL改良DMEM/F12完全培养基重悬后补足培养基，按照1传2的比例进行培养，连续传代20代后，备用；
所述改良DMEM/F12完全培养基为DMEM/F12培养基添加1×NeuroCultSM1NeuronalSupplement。


3.如权利要求1或2所述的基于人脑胶质瘤原代细胞建立荧光裸鼠肿瘤模型的方法，其特征在于，所述改良DMEM/F12完全培养基配方为：DMEM/F12...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘红亚，李俊俊，李继新，魏丹妮，刘霞，王前进，王鲜，
申请(专利权)人：武汉赛尔朗灵科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42