诱导型AAV Rep基因制造技术

本发明专利技术涉及宿主细胞，其包含编码腺相关病毒(AAV)Rep蛋白Rep78和Rep68的核酸，其中一个或多个维持所述Rep78和Rep68蛋白功能的突变已使内部AAV启动子p19失活。本发明专利技术还涉及相应的核酸和包含该核酸的载体，以及用于产生AAV的相应方法。

Induced AAV rep gene

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】诱导型AAVRep基因本专利技术涉及包含编码腺相关病毒(AAV)Rep蛋白Rep78和Rep68的核酸的宿主细胞，其中一个或多个维持所述Rep78和Rep68蛋白功能的突变已使内部AAV启动子p19失活。本专利技术还涉及相应的核酸和包含该核酸的载体，以及用于产生AAV的相应方法。最近，基于腺相关病毒(AAV)的载体的基因治疗试验和产品数量迅速增加。AAV载体在基因治疗中的优势是具有良好的安全性，因为此类载体不具有致病性，即与任何疾病无关，转基因的稳定表达以及转化分裂和非分裂细胞的可能性。重组AAV的产生尤其需要表达通常由AAV基因组编码的AAVRep和Cap蛋白，以产生反式供应的重组病毒。此外，必须使用可以衍生自不同的辅助病毒的辅助基因，最常见的是取自腺病毒(AV)的辅助病毒基因，例如E1A、E1B、E2A、E4orf6或VARNA。此外，需要含有目的基因(GOI)的转移载体。当前用于AAV的生产系统主要依赖于以下技术，然而，这些技术具有一些缺点。AAVrep基因的瞬时转染，例如使用三质粒系统，其包括含有目的基因的转移载体，具有腺病毒辅助功能的质粒以及提供衣壳和复制酶功能的质粒，缺乏可扩展性、健壮性(robustness)、可再现性，并且需要高成本的GMP级DNA。主要基于HeLa细胞的生产细胞系仍需要使用辅助病毒进行感染，因此需要大量纯化，并需要昂贵的证据证明不存在辅助病毒。通过将终止盒插入p19启动子下游的rep基因座进行AAVrep基因的诱导型表达需要插入包含侧翼有两个loxP位点的终止信号的人工内含子(例如SV40Poly(A))。另外，细胞需要Cre重组酶，该重组酶可识别loxP位点并切除终止盒。这必须是可诱导提供的，或者是通过修饰的腺病毒载体提供的，需要昂贵的证据来证明不存在辅助病毒。此外，Cre介导的重组通常仅显示低效率。因此，当前AAV生产系统在可扩展性、健壮性、可再现性、易用性和成本效率方面受到限制。因此，非常需要用于稳定生产AAV载体的不需要瞬时转染和辅助病毒的可扩展系统。因此，本专利技术的技术问题是提供构成该系统的相应的宿主细胞、核酸、载体和方法。上述技术问题的技术方案是通过具有权利要求书中的特征的实施方案来实现的。特别地，第一方面，本专利技术涉及宿主细胞，其包含编码腺相关病毒(AAV)Rep蛋白Rep78和Rep68的核酸，其中一个或多个维持所述Rep78和Rep68蛋白功能的突变已使内部AAV启动子p19失活。在本文中，由于Rep蛋白对细胞有毒，因此难以产生用于生产AAV的稳定生产细胞系。Rep蛋白的表达受E1A调控，而E1A也是AAV生产所必需的。在例如CAP细胞、HEK293细胞或Per.C6细胞的细胞系中，E1A已经组成型表达。总共存在四种Rep蛋白：从p5启动子表达的两种长蛋白(Rep78、Rep68)，以及从位于长Rep蛋白的编码区内部的内部p19启动子表达的两种短蛋白(Rep52、Rep40)(见图1中的示意图)。p5启动子可以被诱导型启动子替代，而Rep78和Rep68编码区的一部分的内部p19启动子却不可以。因此，不可能基于组成型表达E1A的细胞产生包装细胞系/生产细胞系，因为这将导致组成型表达毒性水平的Rep52和Rep40。其他非组成型表达EA1的细胞系需要可诱导的E1A或E1A供给，例如通过腺病毒感染，这导致的上述缺点。本专利技术有利地解决了该问题，本专利技术基于通过防止组成型Rep52和Rep40表达而同时维持所述Rep78和Rep68蛋白功能的突变使内部AAVp19启动子失活。本文所用的术语“腺相关病毒”和“AAV”不限于特定的AAV血清型。在本文中，应该指出，AAVRep蛋白在不同的AAV血清型中是高度保守的。在特定的实施方案中，以上术语是指腺相关病毒血清型2(AAV2)。如本文所用，术语“保持所述Rep78和Rep68蛋白功能”系指这样的事实，即本专利技术的突变不会降低所述蛋白的功能活性，或将所述活性最多降低30％，优选最多25％，最多20％，最多15％，最多12.5％，最多10％，最多7.5％，最多5％，最多4％，最多3％，最多2％或最多1％。在优选实施方案中，本专利技术的一个或多个突变在p19启动子的至少一个调控位点内，优选在SP1-50区(核苷酸817至829)、TATA-20区(核苷酸843至849)、或TATA-35区(核苷酸830至835)。具体地，所述一个或多个突变可以在SP1-50区内，在TATA-20区内，在TATA-35区内，同时在SP1-50区和TATA-20区内，同时在SP1-50区和TATA-35区内，同时在TATA-20区和TATA-35区内，或在所有三个区内，即在SP1-50区、TATA-20区和TATA-35区内。特别地，本专利技术已经表明，即使在一个所述区内的单个核苷酸的突变也有利地导致Rep52和Rep40表达的显着降低。在本文中，如本文所示的所有核苷酸位置系指可在GenBank登录号AF043303下获得的AAV2完整基因组序列。这也适用于所有氨基酸位置。此外，下表1示出了IUPAC的单字母核苷酸命名法的摘录。表1：IUPAC的单字母核苷酸命名法。字母核苷酸WA；TSC；GMA；CKG；TRA；GYC；TBC；G；TDA；G；THA；C；TVA；C；G在优选实施方案中，使内部p19启动子失活的本专利技术的一个或多个突变是沉默突变，即，不改变所编码的氨基酸的突变。优选地，所述一个或多个突变包括至少一个选自731C>D、732A>C、734A>B、737T>C、746A>G、749C>D、752G>H、758G>A、761G>H、764G>H、818G>A、824G>H、830T>V、833T>C、845T>C、846T>C、848A>B或848A>G、849A>T、850G>C和851C>D的突变。在所述一个或多个突变在p19启动子的SP1-50区内的情况下，所述突变包含至少一个选自818G>A和824G>H的突变。在所述一个或多个突变在p19启动子的TATA-20区内的情况下，所述突变包含至少一个选自845T>C、846T>C、848A>B或848A>G和849A>T的突变。在所述一个或多个突变在p19启动子的TATA-35区内的情况下，所述突变包含至少一个选自830T>V和833T>C的突变。在优选实施方案中，所述一个或多个突变包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.宿主细胞，其包含编码腺相关病毒(AAV)Rep蛋白Rep78和Rep68的核酸，其中维持所述Rep78和Rep68蛋白功能的一个或多个突变已使内部AAV启动子p19失活。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170919 EP 17001562.21.宿主细胞，其包含编码腺相关病毒(AAV)Rep蛋白Rep78和Rep68的核酸，其中维持所述Rep78和Rep68蛋白功能的一个或多个突变已使内部AAV启动子p19失活。


2.如权利要求1所述的宿主细胞，其中所述一个或多个突变在p19启动子SP1-50区、TATA-20区和TATA-35区中的至少一个区域内。


3.如权利要求1或权利要求2所述的宿主细胞，其中所述一个或多个突变是沉默突变。


4.如权利要求1至3中任一权利要求所述的宿主细胞，其中所述一个或多个突变包括至少一个选自731C>D、732A>C、734A>B、737T>C、746A>G、749C>D、752G>H、758G>A、761G>H、764G>H、818G>A、824G>H、830T>V、833T>C、845T>C、846T>C、8484A>B、848A>G、849A>T、850G>C和851C>D的突变。


5.如权利要求1至4中任一权利要求所述的宿主细胞，其中所述核酸包含至少一个选自SEQIDNO:1至8、11至14以及34至42的核苷酸序列。


6.如权利要求1至4中任一权利要求所述的宿主细胞，其中所述核酸包含至少一个选自SEQIDNO:15至22、25至28以及43至51的核苷酸序列。


7.如权利要求1或权利要求2所述的宿主细胞，其中所述一个或多个突变是导致...

【专利技术属性】
技术研发人员：克斯汀·海因，妮可·佛斯特，西尔克·维辛，
申请(专利权)人：塞维克制药有限责任公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE