测定人血清中万古霉素和降解产物浓度的方法技术

本发明专利技术属药物浓度监测技术领域，涉及一种液相色谱‑串联质谱法LC‑MS/MS同时测定人血清中万古霉素和晶状降解产物CDP‑1的浓度的方法。本方法以去甲万古霉素为内标，采用甲酸酸化血清后加入定量的乙腈沉淀蛋白，以乙腈和甲酸水作为流动相，通过LC‑MS/MS法测定人血清万古霉素和CDP‑1的浓度。本方法样品取样量少，预处理简单、快速，可用于常规临床患者血清样本中万古霉素和降解产物CDP‑1的浓度测定，尤其可定量肾功能不全患者血液透析后产生不同程度CDP‑1而降低抗菌活性成分万古霉素浓度，能为临床制定和调整万古霉素个体化给药方案，能提高临床疗效和细菌清除率，降低细菌耐药性产生，降低肾毒性等毒副反应的发生。

Determination of vancomycin and degradation products in human serum

【技术实现步骤摘要】
测定人血清中万古霉素和降解产物浓度的方法
本专利技术属药物浓度监测
，涉及检测人血清中药物浓度的方法，具体涉及基于液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)同时测定人血清中万古霉素和晶状降解产物CDP-1(包括2种降谢产物CDP-1-m和CDP-1-M)浓度的方法。
技术介绍
据资料记载，糖肽类抗生素万古霉素在临床治疗实践中已历经60年历史，主要用于干预革兰阳性菌引起的感染，目前仍是治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的首选药物。医疗实践显示，万古霉素药代动力学个体差异大，安全范围小，治疗窗窄，常发生肾毒性和耳毒性等不良反应，故推荐进行治疗药物浓度监测(TDM)。现有技术公开了万古霉素是时间依赖性的抗生素，药代动力学/药效学(PK/PD)显示其疗效与24小时下的药时曲线下面积/最小抑菌浓度(AUC24/MIC)有关，由于AUC较难直接定量，常采用谷浓度为其替代指标。2016年中国药理学会制订了《中国万古霉素治疗药物浓度监测指南》，推荐成人患者万古霉素血药浓度应维持在10-15mg/L，成人严重MRSA感染者血药谷浓度应维持在10～20mg/L，但是血药谷浓度≥15mg/L乃是肾毒性发生率增加的危险因素。有临床研究显示，血液透析患者由于导管污染等原因容易引起感染，革兰阳性菌是主要的病原菌，美国感染病协会(IDSA)指南推荐万古霉素用于MRSA、氨苄西林耐药肠球菌等导管相关感染，但万古霉素的用法用量仍来自国外。为了达到目标靶浓度，IDSA指南推荐对于肾功能不全的患者(包括透析患者)进行万古霉素浓度监测，因而根据血药浓度监测结果调整给药方案，指导临床个体化用药，可提高万古霉素的临床有效性和安全性，但由于万古霉素有效浓度范围较窄，若TDM浓度检测不准确，则影响患者的个体化剂量调整，从而无法达到精准治疗的目的。目前，临床上用于万古霉素TDM的检测方法包括，微生物法、免疫法、高效液相法(HPLC)和LC-MS/MS法等；其中，免疫法操作简便、自动化程度高，是目前万古霉素TDM常用的方法，但有文献报道免疫法相较于HPLC法和LC-MS/MS法，测定结果可能偏高，甚至偏高40％左右，究其原因可能是由于降解产物CDP-1的交互作用。万古霉素主要经肾脏排泄，CDP-1是其在肾脏的晶状降解产物，由一对异构体CDP-1-m和CDP-1-M组成，在透析等肾功能异常的患者中尤为多见。由于TDM血样来源广泛，本申请的前期免疫法和HPLC的TDM检测中，发现HPLC法容易受杂峰等影响色谱峰的积分，导致测定结果偏差大；以及在前期的实验中，发现目前市售的CDP-1的标准品含有一定量的万古霉素，由于CDP-1-m、万古霉素和CDP-1-M均为亲水性化合物且极性接近，难以分离到纯的标准品，尚需定量CDP-1标准品中三个化合物各自的含量。目前，有文献报道采用高效液相色谱法(HPLC)测定万古霉素和降解产物CDP-1的浓度，但是该方法存在血清用量大，200μL，检测时间长，35min，特异性差等缺点，且该方法仅是测定CDP-1-m和CDP-1-M的总浓度，无法分别定量其中的2个降解产物，难以满足目前TDM的要求。鉴于现有方法存在的问题，本申请的专利技术人拟提供一种同时测定人血清中万古霉素和2个降解产物CDP-1-m和CDP-1-M的液质联用法。建立该方法后进行了一系列方法验证，满足2015版药典的相关要求，并用于临床TDM血样的检测，特别是血液透析患者。与本专利技术线相关的参考文献有：[1]HanrahanT，WhitehouseT，LipmanJ，etal.Vancomycin-associatednephrotoxicity：Ameta-analysisofadministrationbycontinuousversusintermittentinfusion.IntJAntimicrobAgents.2015，46(3)：249-253.[2]ForouzeshA，MoisePA，SakoulasG.Vancomycinototoxicity：areevaluationinaneraofincreasingdoses.AntimicrobAgentsChemother.2009，53(2)：483-486.[3]R，LópezCortésLE，MolinaJ，etal.Optimizingtheclinicaluseofvancomycin.AntimicrobAgentsChemother，2016，60(5)：2601-2609.[4]YeZK，ChenYL，ChenK，etal.Therapeuticdrugmonitoringofvancomycin：aguidelineoftheDivisionofTherapeuticDrugMonitoring，ChinesePharmacologicalSociety.JAntimicrobChemother，2016，71(11)：3020-3025.[5]LiuC，BayerA，CosgroveSE，etal.Clinicalpracticeguidelinesbytheinfectiousdiseasessocietyofamericaforthetreatmentofmethicillin-resistantStaphylococcusaureusinfectionsinadultsandchildren：executivesummary.[J].ClinInfectDis，2011，52：e18-e55.[6]IwamotoT，KagawaY，KojimaM.FactorsinfluencingtheoverestimationofplasmavancomycinconcentrationsmeasuredbytheAbbottTDxtechnique.TherDrugMonit，2005，27(1)：58-62.[7]KingeryJR，SowinskiKM，KrausA，etal.Vancomycinassayperformanceinpatientswithend-stagerenaldiseasereceivinghemodialysis.Pharmacotherapy，2000，20(6)：653-656.[8]BackesDW，AboleneenHI，SimpsonJA.Quantitationofvancomycinanditscrystallinedegradationproduct(CDP-1)inhumanserumbyhighperformanceliquidchromatography.JPharmaceutBiomed，1998，16(8)：1281-1287.[9]国家药典委员会.中华人民共和国药典2015年版四部..北京：中国医药科技出版社.9012
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的缺陷和不足，提供基于液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)同时测定人血清中万古本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.测定人血清中万古霉素和降解产物CDP-1浓度的方法，其特征在于，采用高效液相色谱-紫外法测定标准品中CDP-1-m、万古霉素和CDP-1-M的含量，配制相应比例的万古霉素和降解产物标准曲线及质控样品，待测样品经预处理后，经酸性流动相在色谱柱上分离，用串联质谱检测，包括以下步骤：/n1)CDP-1标准品中CDP-1-m、CDP-1-M和万古霉素的含量测定/n采用通用型的C18液相色谱柱，高效液相系统采用通用型高压泵、进样器和紫外检测器，采用乙腈∶磷酸二氢钾缓冲液(5mM，含0.023％磷酸)为9∶91，v/v作为流动相，等度洗脱；/n2)血清样品预处理/n取待测样品于离心管中，加入内标工作液、一定浓度的甲酸水溶液，混匀，加入定量的有机试剂沉淀蛋白，13000rpm离心后，吸取定量上清液，加入5％的乙腈水溶液，混匀待测；/n3)样品分离/n采用Waters通用型超高效液相色谱柱，填料为亚乙基桥杂化颗粒C18柱，液相色谱系统为超高压高分辨率计量泵、控温柱温箱和自动进样器，采用乙腈和0.1％甲酸溶液作为流动相，梯度洗脱；/n4)样品检测/n采用通用型串联质谱检测器检测样品中万古霉素、CDP-1和内标的峰面积；/n质谱电离方式：电喷雾电离源；扫描方式：多反应监测(MRM)正离子模式；离子通道：m/z726.2→m/z 144.2(万古霉素，CDP-1)和m/z 718.2→m/z 144.2(内标)；/n5)浓度计算/n以样品浓度为X轴，待测物峰面积(As)与内标峰面积(Ai)比值为Y轴，进行加权回归分析，标准曲线回归方程以及样品的浓度使用含量分析软件进行计算。/n...

【技术特征摘要】
1.测定人血清中万古霉素和降解产物CDP-1浓度的方法，其特征在于，采用高效液相色谱-紫外法测定标准品中CDP-1-m、万古霉素和CDP-1-M的含量，配制相应比例的万古霉素和降解产物标准曲线及质控样品，待测样品经预处理后，经酸性流动相在色谱柱上分离，用串联质谱检测，包括以下步骤：
1)CDP-1标准品中CDP-1-m、CDP-1-M和万古霉素的含量测定
采用通用型的C18液相色谱柱，高效液相系统采用通用型高压泵、进样器和紫外检测器，采用乙腈∶磷酸二氢钾缓冲液(5mM，含0.023％磷酸)为9∶91，v/v作为流动相，等度洗脱；
2)血清样品预处理
取待测样品于离心管中，加入内标工作液、一定浓度的甲酸水溶液，混匀，加入定量的有机试剂沉淀蛋白，13000rpm离心后，吸取定量上清液，加入5％的乙腈水溶液，混匀待测；
3)样品分离
采用Waters通用型超高效液相色谱柱，填料为亚乙基桥杂化颗粒C18柱，液相色谱系统为超高压高分辨率计量泵、控温柱温箱和自动进样器，采用乙腈和0.1％甲酸溶液作为流动相，梯度洗脱；
4)样品检测
采用通用型串联质谱检测器检测样品中万古霉素、CDP-1和内标的峰面积；
质谱电离方式：电喷雾电离源；扫描方式：多反应监测(MRM)正离子模式；离子通道：m/z726.2→m/z144.2(万古霉素，CDP-1)和m/z718.2→m/z144.2(内标)；
5)浓度计算
以样品浓度为X轴，待测物峰面积(As)与内标峰面积(Ai)...

【专利技术属性】
技术研发人员：范亚新，陈渊成，张菁，郁继诚，彭小林，
申请(专利权)人：复旦大学附属华山医院，
类型：发明
国别省市：上海;31