本发明专利技术公开了一株裂解性大肠杆菌噬菌体RDP‑EC‑16029的分离及应用，该噬菌体宿主为禽大肠杆菌E10，该噬菌体在双平板上能形成直径在0.5‑1毫米的噬菌斑；透过电镜观察噬菌体有一个多面体立体对称的头部，包裹着核酸，直径约70nm，有一个长约120nm的尾，有尾鞘，颈部连着头部和尾部，为有尾病毒目肌尾病毒科；该噬菌体在pH6.0−9.0范围能维持较好的活性，在pH为8.0时，噬菌体效价最高；在30‑40℃效价基本不变；可高效感染宿主菌禽大肠杆菌E10，对养殖环境中禽大肠杆菌E10具有强裂解效用，为工业化生产噬菌体用于养殖环境中禽大肠杆菌E10的防治提供了噬菌体来源。
Isolation and application of rdp-ec-16029 phage
【技术实现步骤摘要】
一株裂解性大肠杆菌噬菌体RDP-EC-16029的分离及应用
本专利技术涉及微生物领域，特别是涉及一种裂解性大肠杆菌噬菌体RDP-EC-16029的分离及应用。
技术介绍
近年来，我国畜牧业发展迅速，规模化、集约化畜禽饲养场呈急剧上升趋势，因此导致饲养密度过大、养殖环境下降等多种问题的出现，使致病菌大量增殖，降低动物对病原菌的抵抗力。因此，抗生素的使用已非常普遍，虽然抗生素治疗有显著效果，但是使用抗生素后动物产生的耐药性也非常显著，超级细菌的出现就是抗生素滥用产生的严重结果之一。现在各国均意识到抗生素滥用产生的问题，在发达国家无抗养殖已经开始流行，瑞典早在1986年迈出第一步，全面禁止抗生素用作饲料添加剂。丹麦也陆续禁止了多种抗生素作为生长促进剂使用，欧盟在2006年全面禁止饲料中添加抗生素。随着我国出台的有关政策，无抗养殖已经成为大趋势。早在2000年，我国就有人研究无抗养殖，通过乳酸菌技术、中兽药技术等的应用，在小范围内实现无抗养殖，近年来，采用复合微生态制剂的无抗饲料有一定的使用效果，但是由于技术不成熟、养殖效益等原因，未能大规模推广。对于细菌性疾病，噬菌体治疗有显著效果。1896年，英国科学家ErnestHankin首次报道了微生物中存在某种抗菌活性物质的现象。两年后，俄罗斯微生物学家NikolayGamaleya在枯草芽孢杆菌中观察到了类似现象。1915年英国科学家FrederickTwort在培养金黄色葡萄球菌的过程中，首次发现菌落上有透明斑出现，并将这一现象解释为病毒感染。1917年，巴黎巴斯德研究所的法裔加拿大微生物学家Felixd’Herelle将这些抗菌活性物质解释为由寄生在细菌中的病毒引起的，并正式命名为噬菌体，噬菌体的研究也由此开始。但是由于人们对于病毒制剂的接受度较低，随着二战期间青霉素等抗生素的出现，科学家们对噬菌体疗法基本放弃研究，开始投入到抗生素研究的洪流中，从1950年-1980年，关于噬菌体治疗细菌性疾病的研究陷入了停顿。1980年后，超级细菌的出现，再加上抗生素滥用导致的问题，人们又重新将目光投回到噬菌体治疗上。噬菌体治疗细菌性疾病具有很多优势。例如，起效快，2-4小时就能杀死病原菌，缓解症状，改善养殖动物的精神状态；对养殖动物安全，噬菌体特异性强，只能杀死相对应的病原菌，对动物肠道有益微生物不会有副作用，因此不会破坏肠道菌群，而抗生素在杀灭病原菌的同时，会导致微生态失衡，引起机会性感染甚至更严重的全身性感染；环境友好，噬菌体是宿主依赖性的，只有在宿主存在时才会发生作用，随着宿主的死亡而死亡，不会在体内残留；防止细菌耐药性，噬菌体作用机制与抗生素不同，治疗效果不受细菌耐药性的影响；基本没有副作用，长期以来，噬菌体在人体、动物、食品中的应用已经有了悠久历史，很少有严重的副作用。本专利技术在于相应国家全面禁抗的号令，解决细菌耐药性，抗生素滥用的问题，从禽粪便中分离纯化出一株裂解性大肠杆菌噬菌体，为禽大肠杆菌的防治提供更多的可能性。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一株治疗禽大肠杆菌病的，安全可靠的裂解性大肠杆菌噬菌体RDP-EC-16029，噬菌体RDP-EC-16029被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年7月10日，保藏编号为CGMCCNo.18196，并提供一株生产该噬菌体的病原菌E10。本专利技术的另一目的在于提供该噬菌体在治疗禽大肠杆菌病中的应用，提供该病原菌在生产该噬菌体的应用。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一株裂解性大肠杆菌噬菌体RDP-EC-16029，其宿主为禽大肠杆菌E10，该噬菌体在双平板上能形成直径在0.5-1毫米的噬菌斑；透过电镜观察噬菌体有一个多面体立体对称的头部，包裹着核酸，直径约70nm，有一个长约120nm的尾，有尾鞘，颈部连着头部和尾部，为有尾病毒目肌尾病毒科。上述一种噬菌体RDP-EC-16029的分离方法，包括宿主禽大肠杆菌E10的分离和噬菌体RDP-EC-16029的分离。优选地，宿主禽大肠杆菌E10的分离步骤如下：从发病养殖场采样，无菌操作取病禽肝脏，在选择性培养基上划线，于37℃培养18-24h后，在培养基上形成圆形、扁平、边缘整齐、表面光滑湿润的红色菌落，挑取典型菌落继续划线纯化3次，然后挑取单菌落接种于5mLLB肉汤中，37℃、200rpm振荡培养8h，得到均匀浑浊的细菌悬浮液，然后经16sRNA分子鉴定和血清型鉴定；鉴定完成后于-80℃保存。优选地，噬菌体RDP-EC-16029的分离步骤如下：（1）粪便处理：从养殖场采取粪便，称取5g鸡粪便加入10mL无菌水中浸泡过夜，然后将过夜后的浸出液10000rpm离心5min，取上清液过0.22μm滤器，将滤出液备用；（2）制备混合菌悬液：取0.2mL菌悬液和0.1mL滤出液加入5mLLB肉汤中，37℃，200rpm振荡培养过夜，然后10000rpm离心5min，取上清液过0.22μm滤器，滤出液备用；（3）噬菌体分离：采用双平板法进行噬菌体的分离，取混合菌悬液滤出液0.1mL和宿主大肠杆菌菌悬液0.2mL混合均匀后，37℃水浴10min，然后铺双平板，放于37℃培养箱培养6-8h后，挑取透明斑于1mL生理盐水中37℃水浴30min后，取0.1mL浸出液和0.2mL菌悬液37℃水浴10min，铺双平板，37℃培养箱培养4-6h纯化，照此步骤纯化3次，即得。优选地，该噬菌体RDP-EC-16029的保藏方式为，将噬菌体增殖液与60%的甘油按照1：1的比例混合后，于液氮中保存。优选地，噬菌体RDP-EC-16029对养殖环境中禽大肠杆菌E10具有强裂解效用，为工业化生产噬菌体用于养殖环境中禽大肠杆菌E10的防治提供了噬菌体来源。优选地，噬菌体RDP-EC-16029在pH6.0−9.0范围能维持较好的活性，噬菌体滴度没有明显变化，而且在pH为8.0时，噬菌体效价最高；可见噬菌体RDP-EC-16029能耐受弱酸和弱碱条件，具有良好的酸碱耐受性。优选地，可高效感染宿主菌禽大肠杆菌E10，其最佳感染复数为0.1。本专利技术的有益效果体现在：（1）本专利技术发现并分离了一种禽大肠杆菌E10，并以该大肠杆菌E10为宿主分离得到了噬菌体RDP-EC-16029，该噬菌体RDP-EC-16029对养殖环境中禽大肠杆菌E10具有强裂解效用，为工业化生产噬菌体用于养殖环境中禽大肠杆菌E10的防治提供了噬菌体来源；（2）在本专利技术中，噬菌体RDP-EC-16029在pH6.0−9.0范围能维持较好的活性，噬菌体滴度没有明显变化，而且在pH为8.0时，噬菌体效价最高；可见噬菌体RDP-EC-16029能耐受弱酸和弱碱条件，具有良好的酸碱耐受性；（3）本专利技术得到的噬菌体在30-40℃效价基本不变；可高效感染宿主菌禽大肠杆菌E10，其最佳感染复数为0.1；（4）通过对本专利技术分离得到的噬菌体的生物学特性研究，为下一步研发新的抑菌药本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一株裂解性大肠杆菌噬菌体RDP-EC-16029，其宿主为禽大肠杆菌E10，该噬菌体在双平板上能形成直径在0.5-1毫米的噬菌斑；透过电镜观察噬菌体有一个多面体立体对称的头部，包裹着核酸，直径约70nm，有一个长约120nm的尾，有尾鞘，颈部连着头部和尾部，为有尾病毒目肌尾病毒科,保藏编号为CGMCC No.18196。/n
【技术特征摘要】
1.一株裂解性大肠杆菌噬菌体RDP-EC-16029，其宿主为禽大肠杆菌E10，该噬菌体在双平板上能形成直径在0.5-1毫米的噬菌斑；透过电镜观察噬菌体有一个多面体立体对称的头部，包裹着核酸，直径约70nm，有一个长约120nm的尾，有尾鞘，颈部连着头部和尾部，为有尾病毒目肌尾病毒科,保藏编号为CGMCCNo.18196。
2.一种如权利要求1所述的噬菌体RDP-EC-16029的分离方法，其特征在于，包括宿主禽大肠杆菌E10的分离和噬菌体RDP-EC-16029的分离。
3.根据权利要求2所述的噬菌体RDP-EC-16029的分离方法，其特征在于，宿主禽大肠杆菌E10的分离步骤如下：
从发病养殖场采样，无菌操作取病禽肝脏，在选择性培养基上划线，于37℃培养18-24h后，在培养基上形成圆形、扁平、边缘整齐、表面光滑湿润的红色菌落，挑取典型菌落继续划线纯化3次，然后挑取单菌落接种于5mLLB肉汤中，37℃、200rpm振荡培养8h，得到均匀浑浊的细菌悬浮液，然后经16sRNA分子鉴定和血清型鉴定；鉴定完成后于-80℃保存。
4.根据权利要求2所述的噬菌体RDP-EC-16029的分离方法，其特征在于，噬菌体RDP-EC-16029的分离步骤如下：
（1）粪便处理：从养殖场采取粪便，称取5g鸡粪便加入10mL无菌水中浸泡过夜，然后将过夜后的浸出液10000rpm离心5min，取上清液过0.22μm滤器，将滤出液备用；
（2...
【专利技术属性】
技术研发人员：杜新永，李先胜，马如霞，
申请(专利权)人：青岛润达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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