检测方法技术

本发明专利技术涉及检测是否存在对环状阳离子多肽抗生素具有抗性的细菌的方法，包括：(a)对测试样品进行质谱法分析并产生质谱输出；其中所述测试样品包含细菌膜或其片段，其中所述片段包含非脂质A组分；(b)在所述质谱输出中鉴定第一确定峰，其表示存在用磷酸乙醇胺修饰的脂质A，其中所述第一确定峰是用磷酸乙醇胺修饰的脂质A的质谱输出中存在的峰，并且其中在天然脂质A的相应质谱输出中无所述第一确定峰；(c)其中存在所述第一确定峰表示存在对环状阳离子多肽抗生素具有抗性的细菌，并且其中无所述第一确定峰表示无对环状阳离子多肽抗生素有抗性的细菌。该方法也用于一种鉴定细菌的环状阳离子多肽抗生素抗性的抑制剂的筛选方法。基质溶液可含有2,5‑二羟基苯甲酸，并有助于天然脂质A和/或改性脂质A作为细菌膜的组成部分的选择性提取、共结晶和电离。

test method

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】检测方法本专利技术涉及抗生素抗性细菌，特别是对环状阳离子多肽抗生素具有抗性的细菌的检测。由于新抗生素的供应有限，抗生素抗性的上升趋势继续威胁着全球健康。革兰氏阴性菌的多药抗性受到特别关注，因为在单一分离株中，它可能与对三类主要抗生素(即(i)β-内酰胺类，其包括质粒编码的超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)水解的头孢菌素和碳青霉烯酶另外水解的碳青霉烯，(ii)氨基糖苷类，其具有16SrRNA甲基化酶修饰其细胞靶标并赋予泛氨基糖苷类抗性，(iii)氟喹诺酮类，其主要具有拓扑异构酶突变)具有抗性有关。由于缺乏用于治疗感染的剩余抗生素，环状阳离子多肽抗生素(例如多粘菌素，如粘菌素和多粘菌素B)已成为特别用于治疗由碳青霉烯抗性肠杆菌科引起的感染的最后手段。此外，此类碳青霉烯抗性肠杆菌科在世界范围内越来越普遍，导致多粘菌素的使用增加，作为“地方病”国家中高度侵袭性感染(例如菌血症)的一线治疗。例如，根据欧洲抗菌药物抗性监测网(EARS-Net)，从血培养中分离出的碳青霉烯抗性肺炎克雷伯菌的患病率2015年在意大利达到35％，在希腊达到63％，而2009年分别为1.3％和43.5％。不幸的是，肠杆菌科对碳青霉烯的抗性增加导致多粘菌素的使用增加，这与对多粘菌素的抗性增加密切相关。肠杆菌科对粘菌素的获得性抗性主要是由多粘菌素靶标脂多糖的修饰引起的。由O-抗原、寡糖核心和脂质A组成的脂多糖(LPS)是位于革兰氏阴性菌外膜中的主要表面糖脂。多粘菌素(例如粘菌素、多粘菌素B和多粘菌素M)是抗生素，其基本结构具有带疏水尾的环肽。多粘菌素通过与环肽的磷脂相互作用破坏细菌细胞膜的结构。在与革兰氏阴性菌外膜中的脂多糖(LPS)结合后，多粘菌素破坏外膜和内膜。疏水尾对于引起膜损伤是重要的，表明类似洗涤剂的作用模式。向脂多糖(例如脂质A)中加入磷酸乙醇胺、4-氨基-L-阿拉伯糖阳离子基团或两者，可减少环状阳离子肽抗生素(例如多粘菌素)与细菌外膜的结合。此类基团的添加可能是由于染色体编码的机制(例如PmrAB或PhoPQ双组分系统中的突变或mgrB基因的改变)。这种改变导致细菌外膜的负电荷降低，导致该膜与环状阳离子肽抗生素(例如多粘菌素)的相互作用降低。最近的一份报告显示，添加磷酸乙醇胺也可能通过mcr-1基因质粒介导，mcr-1基因赋予人和动物分离株第一个已知的质粒编码的粘菌素抗性。最近，在几个质粒主链中(主要在大肠杆菌中)鉴定mcr-1基因。因此迫切需要一种能够快速检测细菌(例如肠杆菌科)的多粘菌素抗性并可能有助于其遏制的测试。确定多粘菌素敏感性的标准参考技术是微量肉汤稀释法，其需要经过严格的关注并且需要很长时间(24小时)才能完成。已经提出了用于确定多粘菌素敏感性的其他技术(盘扩散和Etest)，但需要18-24小时才能产生结果。由于多粘菌素分子在琼脂中扩散不良，假敏感率很高(高达32％)。还使用了在确定浓度的多粘菌素存在下检测细菌生长的生物化学测试(快速多粘菌素NP测试)。在该比色测试中，细菌生长检测(或无)基于碳水化合物代谢。通过pH指示剂的颜色变化可以观察到与肠杆菌科中的碳水化合物代谢相关的酸形成。对该测试结果的解释是主观的，导致重复性问题，并且需要实验室技术人员更加警惕，导致读数错误。虽然对其他常规方法有所改进，但这种生化测试可能需要长达2小时才能产生结果。由于多种基因可能涉及环状阳离子肽抗生素(例如多粘菌素)抗性(例如质粒编码的mcr样基因，如mcr-1和mcr-2，仅具有79％的同一性；并且与多粘菌素抗性相关的染色体编码基因很多)，使用分子生物学工具(例如靶基因的扩增和测序)来检测多粘菌素抗性细菌是不可靠的。对于与多粘菌素抗性相关的染色体编码基因，所涉及的基因修饰(破坏、缺失突变)也未被系统地描述或表征。至于质粒编码的耐药性，肠杆菌科已知有5个mcr基因家族。MCR-2、MCR-3、MCR-4和MCR-5分别与MCR-1仅具有81％、34％、33％和31％的氨基酸同一性。当依赖于使用专用于mcr-1和/或mcr-2检测的可用分子生物学工具时，这种多样性将不可避免地导致系统检测多粘菌素抗性的失败。其他常规方法使用质谱法(MS)。事实上，MS已成为大多数临床实验室可用的标准技术。Bruker的“Bioyper”系统和bioMerieux的“VITEK-MS”系统是标准质谱法系统的示例，并已用于基于使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)获得的质谱图进行细菌鉴定。该系统主要基于蛋白质区分细菌。实际上，所有当前的诊断MS应用都依赖于蛋白质的分析。这是因为蛋白质分别比疏水性分子和强亲水性分子如脂质和多糖更容易离子化。因此，通过常规MALDI-TOFMS分析细菌上LPS和在环状阳离子肽抗生素(例如多粘菌素)抗性期间发生的LPS组成的改变是具有挑战性的。最近，该技术还被开发用于通过检测一些β-内酰胺酶(例如ESBL或碳青霉烯酶)是否存在来检测抗生素抗性机制(例如对β-内酰胺抗生素)。在此，β-内酰胺降解(意指水解)之后进行MS分析以产生质谱，无与天然β-内酰胺相对应的峰表示对β-内酰胺抗生素的抗生素抗性。然而，在多粘菌素的情况下，抗性不是由于抗生素本身的修饰或破坏导致的，因此使用MALDI-TOFMS检测多粘菌素修饰或破坏以检测多粘菌素抗性细菌的策略是不适用的。迄今为止，使用基于质谱法(例如MALDI-TOFMS)的方法用于检测脂质A和经修饰的脂质A需要从大量培养物(例如从500毫升至几升)中纯化实际分子(脂质A)。全程大约需要2到3周，这与临床分析不相容。因此，常规方法对于检测样品中的环状阳离子多肽抗生素(例如多粘菌素)抗性细菌是昂贵和/或耗时和/或低效的，并且需要大量熟练劳动力和昂贵的设备。目前基于MS的方法不足以检测包含完整细菌的粗样品中的环状阳离子多肽抗生素(例如多粘菌素)抗性细菌。本专利技术通过检测包含完整细菌或细菌膜的样品中环状阳离子多肽抗生素抗性细菌，解决了至少一个(例如多于一个)上述问题。因此，本专利技术与临床(例如临床分析)独特地相容，并且可以在不到15分钟内检测环状阳离子多肽抗生素(例如多粘菌素)抗性细菌。有利地，所述方法不需要纯化脂质A分子，并且实际上可直接在完整细菌上或在含有细菌膜或其片段的未纯化样品中鉴定任何脂质A和任何经修饰的脂质A。此外，本专利技术方法可使用小细菌样品(例如包含少于107个细菌细胞)。这使得检测样品中是否存在对环状阳离子多肽抗生素有抗性的细菌所需的时间和材料大大减少。有利地，该方法允许在单次分析中检测质粒编码的环状阳离子多肽抗生素抗性细菌和染色体编码的环状阳离子多肽抗生素抗性细菌。例如，其中已经从感染的患者中分离出细菌，这可使感染此细菌的患者隔开，例如用于隔离检疫感染质粒编码的多粘菌素抗性细菌的患者。此外，通过本专利技术的方法检测染色体编码的环状阳离子多肽抗生素抗性细菌，有利地提供关于脂质A的生理状态的信息，避免了对需要扩增和测序许多基因(其突变可能会产生环状阳离子多肽抗生素抗性)的样品进行分子分析的需要。本专利技术提供了快速(15分钟)和准确的方法(例如诊断方法)，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测是否存在对环状阳离子多肽抗生素具有抗性的细菌的方法，包括：/na.对测试样品进行质谱分析并产生质谱输出；/n其中所述测试样品包含细菌膜或其片段，其中所述片段包含非脂质A组分；/nb.在所述质谱输出中鉴定第一确定峰，其表示存在用磷酸乙醇胺修饰的脂质A，其中所述第一确定峰是用磷酸乙醇胺修饰的脂质A的质谱输出中存在的峰，并且其中在天然脂质A的相应质谱输出中无所述第一确定峰；和/nc.其中存在所述第一确定峰表示存在对环状阳离子多肽抗生素具有抗性的细菌，并且其中无所述第一确定峰表示无对环状阳离子多肽抗生素有抗性的细菌。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170228 GB 1703261.61.一种检测是否存在对环状阳离子多肽抗生素具有抗性的细菌的方法，包括：
a.对测试样品进行质谱分析并产生质谱输出；
其中所述测试样品包含细菌膜或其片段，其中所述片段包含非脂质A组分；
b.在所述质谱输出中鉴定第一确定峰，其表示存在用磷酸乙醇胺修饰的脂质A，其中所述第一确定峰是用磷酸乙醇胺修饰的脂质A的质谱输出中存在的峰，并且其中在天然脂质A的相应质谱输出中无所述第一确定峰；和
c.其中存在所述第一确定峰表示存在对环状阳离子多肽抗生素具有抗性的细菌，并且其中无所述第一确定峰表示无对环状阳离子多肽抗生素有抗性的细菌。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述用磷酸乙醇胺修饰的脂质A是细菌膜或其片段的组成部分。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其中处理所述测试样品以除去盐。


4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述质谱法分析包括MALDI-TOF质谱法分析。


5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一确定峰包括比表示存在天然脂质A的第二确定峰大约120至约125m/z单位的质荷比(m/z)。


6.根据权利要求5所述的方法，其中所述第二确定峰选自：
a.大肠杆菌、志贺氏菌、肺炎克雷伯菌、肠炎沙门氏菌、肠杆菌属和产酸克雷伯菌的峰，其质荷比(m/z)为约1793至约1799m/z，优选为1796.2m/z；
b.肺炎克雷伯菌的峰，其质荷比(m/z)为约1820至约1826m/z，优选为1823.9m/z；
c.肺炎克雷伯菌的峰，其质荷比(m/z)为约1837至约1843m/z，优选为1840m/z；
d.肺炎克雷伯菌的峰，其质荷比(m/z)为约1847至约1853m/z，优选为1850m/z；
e.肺炎克雷伯菌的峰，其质荷比(m/z)为约2059至约2065m/z，优选为2062m/z；
f.肺炎克雷伯菌的峰，其质荷比(m/z)为约2075至约2081m/z，优选为2078m/z；
g.铜绿假单胞菌的峰，其质荷比(m/z)为约1614至约1620m/z，优选为1617.2m/z；
h.鲍曼不动杆菌的峰，其质荷比(m/z)为约1907至约1913m/z，优选为1910.3m/z；
i.沙门氏菌属的峰，其质荷比(m/z)为约1793至约1799m/z，优选为1796.2m/z；
j.沙门氏菌属的峰，其质荷比(m/z)为约1820至约1826m/z，优选为1824m/z；
k.沙门氏菌属的峰，其质荷比(m/z)为约2031至约2037m/z，优选为2034m/z。


7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一确定峰与第二确定峰的强度比率为至少0.10:1。


8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括在所述质谱输出中鉴定第三确定峰，所述第三确定峰包括比表示存在天然脂质A的第二确定峰大约22至约28m/z单位的质荷比(m/z)。


9.根据权利要求8所述的方法，其中所述第二确定峰选自：
a.大肠杆菌、志贺氏菌、肺炎克雷伯菌、肠炎沙门氏菌、肠杆菌属和产酸克雷伯菌的峰，其质荷比(m/z)为约1793至约1799m/z，优选为1796.2m/z；
b.肺炎克雷伯菌的峰，其质荷比(m/z)为约1820至约1826m/z，优选为1823.9m/z；
c.肺炎克雷伯菌的峰，其质荷比(m/z)为约1837至约1843m/z，优选为1840m/z；
d.肺炎克雷伯菌的峰，其质荷比(m/z)为约1847至约1853m/z，优选为1850m/z；
e.肺炎克雷伯菌的峰，其质荷比(m/z)为约2059至约2065m/z，优选为2062m/z；
f.肺炎克雷伯菌的峰，其质荷比(m/z)为约2075至约2081m/z，优选为2078m/z；
g.沙门氏菌属的峰，其质荷比(m/z)为约1793至约1799m/z，优选为1796.2m/z；
h.沙门氏菌属的峰，其质荷比(m/z)为约1820至约1826m/z，优选为1824m/z；
i.沙门氏菌属的峰，其质荷比(m/z)为约2031至约2037m/z，优选为2034m/z。


10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第三确定峰与第二确定峰的强度比率为至少约0.15:1，或为至少约0.6:1。


11.根据前述权利要求中任一项所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：杰拉尔德·拉鲁伊莫姆斯，劳伦特·多特特，阿兰·菲卢克斯，
申请(专利权)人：帝国理工学院创新有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB