PD1-CTLA4和/或PDL2-CTLA4在制备预测AML预后试剂盒中的应用制造技术

本发明专利技术提供了PD1‑CTLA4和/或PDL2‑CTLA4在制备预测AML预后试剂盒中的应用。是基于本发明专利技术发明专利技术人首次发现AML患者骨髓中PD1与CTLA4，以及PDL2与CTLA4的表达情况与AML患者的预后相关。当PD1与CTLA4，和/或PDL2与CTLA4同时表达比例高时，表明AML患者临床预后差的可能性较大。PD1与CTLA4联合和/或PDL2与CTLA4联合表达比例对于AML患者的预后判断和临床治疗方案的制定具有重要的指导意义，可为AML患者的联合应用免疫检查点抑制剂PD1‑CTLA4和PDL2‑CTLA4提供更多的临床预后研究资料，具有广阔的应用前景。

The application of pd1-ctla4 and / or pdl2-ctla4 in the preparation of prognosis kit for AML

【技术实现步骤摘要】
PD1-CTLA4和/或PDL2-CTLA4在制备预测AML预后试剂盒中的应用
本专利技术属于生物医学领域，特别涉及PD1-CTLA4和/或PDL2-CTLA4在制备预测AML预后试剂盒中的应用。
技术介绍
急性髓系白血病(acutemyeloidleukemia，AML)是成人白血病中最常见的类型，发病率为3.7/100000。AML患者的预后随着年龄的增长而变差，60岁以上患者的5年生存率低于10％。AML是由多种遗传因素、环境变化及其复杂的相互作用引起的。根据患者的细胞遗传学和分子生物学特征，可将其分为低危，中危和高危三类。尽管不同类别的AML患者受益于化学疗法和造血干细胞移植，但这些患者的预后差异很大。AML患者的不同预后提示其他关键因素(例如细胞免疫)也会影响治疗效果。众所周知，癌症的免疫逃避和异常的免疫监视在癌症的发生和发展中起着至关重要的作用。程序性死亡1(programmedcelldeath1，PD-1)，程序性死亡1配体1(programmedcelldeath1ligand1,PD-L1)和程序性死亡1配体2(programmedcelldeath1ligand2,PD-L2)在癌细胞免疫逃逸中的研究使其成为近年来最有前途的细胞治疗方法之一。作为免疫检查点(immunecheckpoint,IC)，PD-1和PD-L1抑制剂已在多种实体瘤中表现示出显著作用，但人们对IC在白血病中的作用了解甚少。少数有报道显示，通过分析生存曲线，高表达PD-L1，并伴有核磷素1(nucleophosmin1,NPM1)和fms相关受体酪氨酸激酶3(fmsrelatedreceptortyrosinekinase3,FLT3)突变的AML患者预后较差，同时，高表达PD-1与T细胞免疫球蛋白3阳性(Tcellimmunoglobulin3,TIM3)T细胞与造血干细胞移植后AML患者的复发密切相关。此外，根据癌症基因组图谱(TheCancerGenomeAtlas,TCGA)数据库中AML的核糖核酸(RibonucleicAcid，RNA)测序数据，PD-L1在肿瘤蛋白p53(tumorproteinp53,TP53)突变和复发性突变患者中高表达，并且与危险分层呈正相关。这些发现表明，PD-1和PD-L1抑制剂可能是AML的新型治疗策略。目前，PD-1和PD-L1抑制剂也正在AML中进行临床试验。尽管已有研究通过生存曲线分析了具有某种类型突变的AML患者中PD-L1的预后作用，但是，众所周知，IC之间可能会共表达并参与免疫抑制网络。目前仍然缺乏针对不同IC表达模式及IC联合的系统分析，而无法全面评估AML患者的预后。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供PD1-CTLA4和/或PDL2-CTLA4在制备预测AML预后试剂盒中的应用。当检测到高表达的PD1-CTLA4和/或PDL2-CTLA4时，表明AML患者的预后不良可能性大，可以作为预测AML患者预后评估的指标。本专利技术的另一目的在于提供一种预测AML预后的试剂盒。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：PD1-CTLA4和/或PDL2-CTLA4在制备预测AML预后试剂盒中的应用，是基于本专利技术的专利技术人首次发现AML患者骨髓中PD1-CTLA4和PDL2-CTLA4表达情况与AML患者的预后相关。所述的PD1-CTLA4是指PD1和CTLA4基因联合；所述的PDL2-CTLA4是指PDL2和CTLA4基因联合。在所述的应用中，通过检测临床患者的骨髓中PD1基因和PDL2基因中的一种或两种的表达量，以及CTLA4基因的表达量，结合内参基因的表达量，进行统计学分析，得到基因的表达水平，从而预测AML预后。所述的内参基因优选为18SrRNA。所述的统计学分析方法优选为ΔΔCT法；表达水平＝2^(-ΔΔCT)，ΔΔCT＝ΔCT临床患者–ΔCT正常人，ΔCT临床患者＝(CT基因-CT内参)，ΔCT正常人＝(CT基因-CT内参)，CT基因和CT内参通过实时荧光定量PCR方法检测得到。所述的预测具体指：①当PD1的表达水平≥1.1和CTLA4的表达水平≥0.5时，和/或当PDL2的表达水平≥0.4和CTLA4的表达水平≥0.5时，AML患者临床预后差的可能性较大；②当PD1的表达水平≥1.1或CTLA4的表达水平≥0.5时，和/或当PDL2的表达水平≥0.4或CTLA4的表达水平≥0.5时，AML患者临床预后差的可能性相对较大；③当PD1的表达水平<1.1和CTLA4的表达水平<0.5时，和/或当PDL2的表达水平<0.4和CTLA4的表达水平<0.5时，AML患者临床预后好的可能性较大。一种预测AML预后的试剂盒，包括用于扩增PD1cDNA的引物和用于扩增PDL2cDNA的引物中的一种或两种，和用于扩增CTLA4cDNA的引物。所述的用于扩增PD1cDNA的引物如下：PD1(F):5'-CTCAGGGTGACAGAGAGAAG-3'；PD1(R):5'-GACACCAACCACCAGGGTTT-3'；所述的用于扩增PDL2cDNA的引物如下：PDL2(F):5'-ACAGTGCTATCTGAACCTGTGG-3'；PDL2(R):5'-CTGCAGGCCACCGAATTCTT-3'；所述的用于扩增CTLA4cDNA的引物如下：CTLA4(F):5'-GCCCTGCACTCTCCTGTTTTT-3'；CTLA4(R):5'-GGTTGCCGCACAGACTTCA-3'。所述的试剂盒还包括用于扩增内参的引物，具体如下:18SrRNA(F):5'-CGGCGGCTTTGGTGACTCTAGA-3'；18SrRNA(R):5'-CCTGCTGCCTTCCTTGGATGTG-3'。所述的试剂盒还包括用于分离骨髓单个核细胞的试剂、用于总RNA提取的试剂、用于逆转录PCR(Reversetranscriptionpolymerasechainreaction,RT-PCR)的试剂、用于实时定量PCR(quantitativerealtimePCR,qRT-PCR)的试剂中的任意一种或至少两种。所述的用于分离骨髓单个核细胞的试剂优选为淋巴细胞分离液(Ficoll)。所述的用于总RNA提取的试剂优选为TRIZOL。上述预测AML预后的试剂盒在非诊断检测PD1-CTLA4和/或PDL2-CTLA4表达中应用。所述的应用包括如下步骤：(1)取待测骨髓样本，分离得到单个核细胞；(2)在步骤(1)得到的单个核细胞中加入总RNA提取的试剂，混匀；(3)加入氯仿，混匀后进行离心；(4)吸取上层液体，加入异丙醇后离心去上清；(5)乙醇洗涤，干燥，得到RNA样品；(6)将步骤(5)得到的RNA样品逆本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.PD1-CTLA4和/或PDL2-CTLA4在制备预测AML预后试剂盒中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.PD1-CTLA4和/或PDL2-CTLA4在制备预测AML预后试剂盒中的应用。


2.根据权利要求1所述的PD1-CTLA4和/或PDL2-CTLA4在制备预测AML预后试剂盒中的应用，其特征在于：通过检测临床患者的骨髓中PD1和PDL2中的一种或两种的表达量，以及CTLA4基因的表达量，结合内参基因的表达量，进行统计学分析，得到基因的表达水平，从而预测AML预后。


3.根据权利要求2所述的PD1-CTLA4和/或PDL2-CTLA4在制备预测AML预后试剂盒中的应用，其特征在于：所述的内参基因为18SrRNA；所述的统计学分析方法为ΔΔCT法；表达水平＝2^(-ΔΔCT)，ΔΔCT＝ΔCT临床患者–ΔCT正常人，ΔCT临床患者＝(CT基因-CT内参)，ΔCT正常人＝(CT基因-CT内参)；CT基因和CT内参通过实时荧光定量PCR方法检测得到；所述的预测具体指：
①当PD1的表达水平≥1.1和CTLA4的表达水平≥0.5时，和/或当PDL2的表达水平≥0.4和CTLA4的表达水平≥0.5时，AML患者临床预后差的可能性较大；
②当PD1的表达水平≥1.1或CTLA4的表达水平≥0.5时，和/或当PDL2的表达水平≥0.4或CTLA4的表达水平≥0.5时，AML患者临床预后差的可能性相对较大；
③当PD1的表达水平<1.1和CTLA4的表达水平<0.5时，和/或当PDL2的表达水平<0.4和CTLA4的表达水平<0.5时，AML患者临床预后好的可能性较大。


4.一种预测AML预后的试剂盒，其特征在于：包括用于扩增PD1cDNA的引物和用于扩增PDL2cDNA的引物中的一种或两种，和用于扩增CTLA4cDNA的引物。


5.根据权利要求4所述的预测AML预后的试剂盒，其特征在于：
所述的用于扩增PD1cDNA的引物如下：
PD1(F):5'-CTCAGGGTGACAGAGAGAAG-3'；
PD1(R):5'-GACACCAACCACCAGGGTTT-3'；
所述的用于扩增PDL2cDNA的引物如下：
PDL2(F):5'-ACAGTGCTATCTGAACCTGTGG-3'；
PDL2(R):5'-CTGCAGGCCACCGAATTCTT-3'；
所述的用于扩增CTLA4cDNA的引物如下：
CTLA4(F):5'-GCCCTGCACTCTCCTGTTTTT-3'；
CTLA...

【专利技术属性】
技术研发人员：李扬秋，陈存特，梁朝峰，曾成武，陈少华，王彩霞，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东;44