一种L型稀有己酮糖的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种L型稀有己酮糖的制备方法,其包括，以甘油和焦磷酸为底物，加入含有L‑鼠李树胶糖‑1‑磷酸醛缩酶、甘油磷酸氧化酶、过氧化氢酶、酸性磷酸酶、马肝醇脱氢酶、NADH氧化酶建立多酶反应体系进行酶催化反应；将酶催化反应产物分离、纯化。本发明专利技术原料价格低廉，不用甘油激酶，不需要ATP进行底物磷酸化生产甘油三磷酸，大大降低生产L型稀有己酮糖的成本，本发明专利技术将马肝醇脱氢酶与NADH氧化酶相结合生产L‑甘油醛，减少NAD

A preparation method of L-type rare hexonose

【技术实现步骤摘要】
一种L型稀有己酮糖的制备方法
本专利技术属于L型稀有己酮糖的酶催化制备
，具体涉及一种L型稀有己酮糖的制备方法。
技术介绍
稀有己酮糖是一类在自然界中存在但含量很低、同时具有重要生理功能的一类单糖及其衍生物。L-构型包括L-山梨糖、L-果糖和L-塔格糖等，具有低热量、天然甜味等优势，可作为功能性甜味剂，同时具有抗癌、抗肥胖、神经保护、清除自由基等生理活性，在生命医药、化妆品、膳食等领域拥有广泛的应用前景。因此，完善稀有糖合成体系具有重要意义。生产L型稀有己酮糖的方法有化学合成法和生物转化法两种。传统的化学合成法步骤繁琐，副反应较多，且很难得到单一构型的产物。相对于化学合成法，酶法因其反应条件温和，高效和立体选择性好而逐渐成为该领域的主流。迄今为止，许多酶促反应依赖于两种或多种糖之间通过异构化或差向异构化来获得各种稀有己酮糖(如Izumoring方法)。但是，由于涉及热力学平衡，转化率较低，同时产品难以分离与纯化。因此，亟待开发一种低成本，低污染，高产率的适合规模化生产稀有己酮糖的新方法。
技术实现思路
本部分的目的在于概述本专利技术的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和专利技术名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和专利技术名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本专利技术的范围。本专利技术所要解决的技术问题是提供一种L-型稀有己酮糖的制备方法，该方法通过体外多酶催化甘油以制备L-型稀有己酮糖，具有产率高，生产成本低，无污染等优点。因此，作为本专利技术其中一个方面，本专利技术克服现有技术中存在的不足，提供一种L型稀有己酮糖的制备方法。为解决上述技术问题，本专利技术提供了如下技术方案：一种L型稀有己酮糖的制备方法,其包括，以甘油和焦磷酸为底物，加入含有L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶、甘油磷酸氧化酶、过氧化氢酶、酸性磷酸酶、马肝醇脱氢酶、NADH氧化酶建立多酶反应体系进行酶催化反应；将酶催化反应产物分离、纯化。作为本专利技术所述的L型稀有己酮糖的制备方法的一种优选方案：所述甘油，浓度为300～900mM。作为本专利技术所述的L型稀有己酮糖的制备方法的一种优选方案：所述焦磷酸为焦磷酸盐，所述焦磷酸的浓度为5～125mM。作为本专利技术所述的L型稀有己酮糖的制备方法的一种优选方案：所述焦磷酸盐包括焦磷酸二氢二钠和焦磷酸四钠，所述焦磷酸二氢二钠：焦磷酸四钠为3:2。作为本专利技术所述的L型稀有己酮糖的制备方法的一种优选方案：所述酸性磷酸酶的用量为1U/mL，所述L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶用量为1～8U/mL。作为本专利技术所述的L型稀有己酮糖的制备方法的一种优选方案：所述甘油磷酸氧化酶的用量为14～112U/mL。作为本专利技术所述的L型稀有己酮糖的制备方法的一种优选方案：所述过氧化氢酶的用量为10U/mL；所述马肝醇脱氢酶的用量为16U/mL。作为本专利技术所述的L型稀有己酮糖的制备方法的一种优选方案：所述NADH氧化酶的用量为30～34U/mL。作为本专利技术所述的L型稀有己酮糖的制备方法的一种优选方案：所述酶催化反应的条件是25～45℃反应3～24h。作为本专利技术所述的L型稀有己酮糖的制备方法的一种优选方案：多酶催化反应体系中还包括，缓冲液、NAD+和二价镍离子；其中，所述缓冲液为pH值4.0～8.5的Tris-Hcl缓冲液，所述Tris-Hcl缓冲液浓度为20～50mM；所述二价镍离子浓度为1mM；所述NAD+浓度为1mM。本专利技术的有益效果：(1)原料价格低廉。本专利技术以甘油和焦磷酸为原料，而不是使用昂贵的L-甘油醛为原料。因此，L型稀有己酮糖生产成本低，适于大规模生产。(2)本专利技术制备方法不用甘油激酶，不需要ATP进行底物磷酸化生产甘油三磷酸，大大降低生产L型稀有己酮糖的成本。(3)本专利技术将马肝醇脱氢酶与NADH氧化酶相结合生产L-甘油醛，减少NAD+的使用。术语“酶催化反应”意指在生物催化剂-酶作用下进行的化学反应。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：图1为肝醇脱氢酶和NADH氧化酶相结合生产L-甘油醛。图2为转化甘油和焦磷酸生成转化L-果糖的体外多酶分子机器催化途径的示意图；其中，RhaD，L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶；GPO，甘油磷酸氧化酶；Catalase过氧化氢酶；PhoN-Sf，酸性磷酸酶；HLADH，马肝醇脱氢酶；NOX，为NADH氧化酶。图3为SDS-PAGE检测7个关键酶；A为酸性磷酸酶；B为L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶；C为L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶；D为D-果糖-1,6-二磷酸醛缩酶；第1列为蛋白Maker；第2列,诱导前全细胞；第3列,诱导后全细胞；第4列,细胞破碎液上清；第5列，纯化后蛋白；E为马肝醇脱氢酶；F为NADH氧化酶；G为甘油磷酸氧化酶；第1列为蛋白Maker；第2列,诱导前全细胞；第3列,诱导后全细胞；第4列，纯化后蛋白。图4为用HPLC检测以甘油为底物经过酶促反应后的产物。图5为单次转化甘油生成L-果糖的体外多酶分子机器催化体系的时间效应曲线；图6为为转化甘油和焦磷酸生成L-果糖和L-塔格糖的体外多酶分子机器催化途径的示意图；其中，FucA，L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶；GPO，甘油磷酸氧化酶；Catalase过氧化氢酶；PhoN-Sf，酸性磷酸酶；HLADH，马肝脱氢酶；NOX，为NADH氧化酶。图7为用HPLC检测以甘油为底物经过酶促反应后的产物。图8为单次转化甘油生成L-果糖和L-塔格糖的体外多酶分子催化体系的时间效应曲线；图9为转化甘油和焦磷酸生成L-山梨糖的体外多酶分子机器催化途径的示意图；其中，FruA，D-果糖-1,6-二磷酸醛缩酶；GPO，甘油磷酸氧化酶；Catalase过氧化氢酶；PhoN-Sf，酸性磷酸酶；HLADH，马肝醇脱氢酶；NOX，为NADH氧化酶。图10为用HPLC检测以甘油为底物经过酶促反应后的产物。图11为单次转化甘油生成L-山梨糖的体外多酶分子催化体系的时间效应曲线。具体实施方式为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本专利技术的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本专利技术，但是本专利技术还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本专利技术内涵的情况下做类似推广，因此本专利技术不受下面公开的具体实施例的限制。其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本专利技术至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种L型稀有己酮糖的制备方法,其特征在于：包括，/n以甘油和焦磷酸为底物，加入含有L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶、甘油磷酸氧化酶、过氧化氢酶、酸性磷酸酶、马肝醇脱氢酶、NADH氧化酶建立多酶反应体系进行酶催化反应；/n将酶催化反应产物分离、纯化。/n

【技术特征摘要】
1.一种L型稀有己酮糖的制备方法,其特征在于：包括，
以甘油和焦磷酸为底物，加入含有L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶、甘油磷酸氧化酶、过氧化氢酶、酸性磷酸酶、马肝醇脱氢酶、NADH氧化酶建立多酶反应体系进行酶催化反应；
将酶催化反应产物分离、纯化。


2.如权利要求1所述的L型稀有己酮糖的制备方法,其特征在于：所述甘油，浓度为300～900mM。


3.如权利要求1或2所述的L型稀有己酮糖的制备方法,其特征在于：所述焦磷酸为焦磷酸盐，所述焦磷酸的浓度为5～125mM。


4.如权利要求3所述的L型稀有己酮糖的制备方法,其特征在于：所述焦磷酸盐包括焦磷酸二氢二钠和焦磷酸四钠，所述焦磷酸二氢二钠：焦磷酸四钠为3:2。


5.如权利要求1或2所述的L型稀有己酮糖的制备方法,其特征在于：所述酸性磷酸酶的用量为1U/mL，所述L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶用量为1～8U/mL。

【专利技术属性】
技术研发人员：李子杰，高晓冬，李芬，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32