一个具有自主转座活性的逆转录转座子Ra-RARE-1及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一个具有自主转座活性的逆转录转座子Ra‑RARE‑1及其应用。本发明专利技术首次提供了一个具有自主转座活性的逆转录转座子Ra‑RARE‑1，来源于正红树基因组，其序列长度为6998bp。该逆转录转座子具有自主转录和转座能力，能够进行自主增殖，且该逆转录转座子活性较低，将该逆转录转座子转基因到其他真核基因组中，极大降低了常规逆转录转座子大量增殖导致的对基因组的有害影响，同时由于逆转录转座子特殊的转座机制，其新产生的拷贝可稳定地存在于基因组的插入位点，从而使得基因功能分析及分子育种过程中产生的特定性状得到稳定的维持；因此，该逆转录转座子在基因功能分析或分子育种中具有广阔的应用前景。

A retrotransposon ra-rare-1 with autonomous transposable activity and its application

【技术实现步骤摘要】
一个具有自主转座活性的逆转录转座子Ra-RARE-1及其应用
本专利技术属于生物
更具体地，涉及一个具有自主转座活性的逆转录转座子Ra-RARE-1及其应用。
技术介绍
转座子(transposon)是一段能在基因组中移动的DNA序列，现已发现其广泛存在于动植物基因组中。转座子的发现大多是因其插入到基因中或基因附近导致了基因表达改变从而产生了一定的表型差异；例如，最早发现的Ac/Ds转座子是因其对色素形成基因的插入打断导致玉米粒呈现紫色、黄色和紫色斑点三种表型；此外还有果蝇中的Pelement转座子，以及水稻中的mPing转座子等，这些转座子都是由于他们的插入突变导致表型的产生之后才被发现的。LTR逆转录转座子的转座以RNA为媒介，在逆转录酶的作用下反转录成DNA，最终插入到基因组的靶位点上。这种“复制-粘贴”的转座机制使其在垂直和水平遗传过程中可产生高度异质和数量巨大的子拷贝；同时，LTR逆转录转座子转座能引起基因内或者基因附近的稳定突变，该特性可应用于基因功能的研究及分子育种工作研究。目前，可用作诱变工作的转座子十分稀少，但其应用十分广泛；例如，“睡美人”(SleepingBeauty)转座子以及PiggyBac转座子被广泛用于人的培养细胞、小鼠胚系细胞等脊椎动物细胞中，作为基因转移、基因功能研究以及基因治疗等领域的基因工程工具；Ac/Ds转座子和Pelement转座子目前已分别开发为昆虫、植物转基因技术的常规工具转座子。然而，随着基因编辑技术多样化的需求不断增加，由于目前已有的转座子的序列的特殊性，已不能完全满足科研需求及具体应用的需要。因此，亟需开发具有不同转座活性的转座子，用于产生可诱导的、大量稳定的遗传变异类型。此外，转座子的转座在产生大量的遗传多样性的同时，其作为一种内源的诱变因素，所产生的影响多数情况下对宿主本身仍是不利的，基因组中大部分的转座子并不具备转座的活性；这不仅由于转座子本身序列的突变导致其自身转座能力的丧失，还因为转座子通常受到来自宿主基因组表观遗传的调控，如DNA甲基化、组蛋白修饰、小RNA介导的转录前和转录后调控等。这些调控机制并非一成不变的，当响应不同的内、外环境条件，如病菌入侵、高温、高盐、寒冷等各类胁迫条件，机体对于转座子的控制程度一般会有所降低，部分转座子随之逃脱宿主的抑制，重新获得扩增、转座的能力；在此过程中，座子转座导致的一系列的遗传多样性又会使物种在进化过程中具有优势。因此，转座子与宿主基因组的冲突与协作是个动态演化的过程，一直是群体遗传学的重要课题。利用基因组学手段开发外源的转座子，转入新基因组(nativegenome)中，研究转座子与宿主基因组的冲突及双方相互作用的模式，对阐明生物维持基因组稳定性的进化机制、揭示基因组进化的普遍规律具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有转座子的缺陷和不足，提供一个具有自主转座活性的逆转录转座子Ra-RARE-1及其应用。本专利技术的目的是提供一个具有自主转座活性的逆转录转座子Ra-RARE-1。本专利技术另一目的是提供一种表达盒。本专利技术又一目的是提供一种重组表达载体。本专利技术再一目的是提供所述逆转录转座子Ra-RARE-1在基因功能分析或分子育种中的应用。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：本专利技术首次提供了一个具有自主转座活性的逆转录转座子Ra-RARE-1，其全长序列如SEQIDNO：1所示，其序列长度为6998bp，该逆转录转座子Ra-RARE-1来源于生长于热带亚热带海岸潮间带红树植物，正红树(Rhizophoraapiculata)基因组。本专利技术用含有该逆转录转座子拷贝和HIS3基因的重组表达载体转化酿酒酵母，验证了该逆转录转座子具有自主转录和转座能力，能够进行自主增殖。本专利技术还提供了一种表达盒，包括所述的逆转录转座子Ra-RARE-1。优选地，所述表达盒还包括用于抗性筛选的基因序列和人工合成的内含子序列。优选地，所述人工合成的内含子序列为AI序列，其序列如SEQIDNO：4所示。优选地，所述用于抗性筛选的基因序列为HIS3基因序列，其序列如SEQIDNO：5所示。本专利技术还提供了一种重组表达载体，包括所述的逆转录转座子Ra-RARE-1。本专利技术通过抗性筛选基因的活性有无监测该逆转录转座子Ra-RARE-1的转座增殖事件，验证了该逆转录转座子具有转座活性；该逆转录转座子活性较低，将该逆转录转座子转基因到其他真核(如拟南芥)基因组中，其转座后对于宿主基因的影响将有助于基因功能的研究，其对宿主基因影响所产生的有益性状将对分子育种工作提供技术支持。因此，所述逆转录转座子Ra-RARE-1在基因功能分析或分子育种中的应用，也应在本专利技术的保护范围之内。优选地，所述应用为逆转录转座子Ra-RARE-1在产生突变体或作为转基因载体中的应用。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术首次提供了一个具有自主转座活性的逆转录转座子Ra-RARE-1，来源于正红树基因组，其序列长度为6998bp；本专利技术用含有该逆转录转座子拷贝和HIS3基因的重组表达载体转化酿酒酵母，验证了该逆转录转座子具有自主转录和转座的特性；通过抗性筛选基因的活性有无监测逆转录转座子的转座增殖事件，验证了该逆转录转座子具有转座活性；另外，本专利技术发现该逆转录转座子活性较低，将该逆转录转座子转基因到其他真核(如拟南芥)基因组中，极大降低了常规逆转录转座子大量增殖导致的对基因组的有害影响，同时由于逆转录转座子特殊的转座机制，其新扩增出的子拷贝可稳定的存在于基因组的插入位点，从而使得基因功能分析及分子育种过程中产生的特定性状得到稳定的维持；因此，该逆转录转座子在基因功能分析或分子育种中具有广阔的应用前景。附图说明图1是重组表达载体pYES2-RARE-1-mHIS3AI结构图及其作用机制；其中，(A)图是pYES2质粒图谱；(B)图是逆转录转座子Ra-RARE-1转座实验原理图。图2是逆转录转座子Ra-RARE-1在酵母中的转座活性分析结果图；其中，(A)图是三种转入不同载体(pYES2-RARE-1-mHIS3，pYES2-RARE-1-HIS3mAI，pYES2-RARE-1-mHIS3AI)的酿酒酵母在SC-His平板上的生长情况结果图；(B)图是SC-His平板上转入pYES2-RARE-1-mHIS3AI的酵母单菌落转接到SC-His+FOAr平板的生长情况结果图。图3是SSAP实验转座事件的验证结果图；其中，第1泳道为Marker，第2～10泳道分别为含5-FOA的SC-His板上不同酵母单克隆。图4是通过高通量测序验证Ra-RARE-1在拟南芥基因组中的扩增活性结果；其中，(A)图是Ra-RARE-1转基因拟南芥高通量基因组重测序结果图；(B)图是荧光定量PCR验证转座活性结果图。具体实施方式以下结合具体实施例来进一步说明本专利技术，但实施例并不对本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一个具有自主转座活性的逆转录转座子Ra-RARE-1，其特征在于，其全长序列如SEQID NO：1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一个具有自主转座活性的逆转录转座子Ra-RARE-1，其特征在于，其全长序列如SEQIDNO：1所示。


2.一种表达盒，其特征在于，包括权利要求1所述的逆转录转座子Ra-RARE-1。


3.根据权利要求2所述的表达盒，其特征在于，还包括用于抗性筛选的基因序列和人工合成的内含子序列。


4.根据权利要求3所述的表达盒，其特征在于，所述人工合成的内含子序列为AI序列，其序列如SEQIDNO：4所示。

【专利技术属性】
技术研发人员：唐恬，王玉帅，张添元，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东;44