一种肝癌细胞转移检测用的单克隆抗体及试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种肝癌细胞转移检测用的单克隆抗体及试剂盒，该抗体能够特异性的结合本发明专利技术的RRM2B蛋白，并且具有较好的结合能力以及特异性，适宜大规模推广使用。

A monoclonal antibody and kit for detection of liver cancer cell metastasis

【技术实现步骤摘要】
一种肝癌细胞转移检测用的单克隆抗体及试剂盒
本专利技术涉及检测领域，具体的涉及一种用于肝癌细胞转移检测用的单克隆抗体及相应的试剂盒。
技术介绍
核糖核苷酸还原酶（ribonueleotidereductase，RR）广泛分布于各种生物细胞中，其作用是参与核糖核苷酸还原成脱氧核糖核苷酸的过程，在核苷酸代谢过程中发挥着中心作用，是唯一使核糖核苷酸转变为脱氧核糖核苷酸的酶。而脱氧核糖核苷酸是DNA合成和修复的原材料，因此该酶是DNA通路中合成和修复的限速酶。RR全酶结构包括大亚基α和小亚基β，只有形成α2β2异四聚体结构才能具备活性。在人体中RR由3个亚基构成，包括1个大亚基[核糖核苷酸还原酶M1（ribonueleotidereductaseM1，RRM1）]和2个小亚基（RRM2和RRM2B）构成。由于RR对于DNA的合成发挥着关键的作用，因此它与恶性肿瘤生物学行为、转移潜能和肿瘤耐药的产生都有重要影响。RRM2B基因是位于8q22.3的核基因，编码p53-诱导型核糖核苷酸还原酶（RNR）的小亚基（p53R2）。RNR是一种还原酶，可以催化核糖核苷酸（NDP）还原生成相应脱氧核糖核苷酸（dNDP），是体内dNTP从头合成的限速酶和关键酶。RNR包含酶活性中心(RRM1)和底物特异结合位点（RRM2或p53R2）；位于酶活性中心的自由基可以催化NDP还原为dNDP；dNTPs在细胞内的平衡通过RNR酶的底物特异性结合位点的变构受到调控。目前研究表明，RRM2B与多种肿瘤的发生和发展密切相关，在不同类型的肿瘤中发挥类似癌基因或抑癌基因的功能。特别是研究表明，RRM2B在肝细胞癌中表达降低，并与患者的肝内转移呈负相关。因此通过检测RRM2B的表达量来诊断肝癌已经是可行的技术。而且已有研究表明，而RRM2B的表达与肝细胞癌的患者预后密切相关，RRM2B表达水平高的患者其术后生存期比表达低的患者生存期长；COX回归模型单因素和多因素分析结果显示，RRM2B蛋白的表达水平是影响肝细胞癌预后的独立因素之一。因此，RRM2B已经成为评估肝细胞癌预后的一项有效指标。CN201310606030.2中也公开了核糖核苷酸还原酶亚基M2B(Ribonucleoside-diphosphatereductasesubunitM2B，RRM2B)基因或其蛋白检测试剂用于制备诊断肝癌细胞转移的试剂盒。但是由于常规的核酸检测需要复杂的仪器设备，在偏远山区或者普通社区并不适宜推广使用，而针对该基因的抗体检测技术却可以通过试纸条简单的实现检测，而且不需要任何仪器设备，方便快捷，适宜推广使用。因此，针对RRM2B的抗体研究变得尤为重要。虽然目前已有相应的抗体，但是抗体并非特异性针对相应的预后片段抗原所做的，而且抗体的结合活性也有待进一步的提高。。
技术实现思路
本专利技术提供一种RRM2B基因的编码序列如SEQIDNO.：1所示；一种RRM2B蛋白序列如SEQIDNO.2所示。在另一优选例中，所述的RRM2B蛋白用于制备检测试剂包括RRM2B的特异性抗体。另外一方面，本专利技术提供一种特异性结合RRM2B蛋白的单克隆抗体。具体的，该单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列为SEQ.ID.NO.3:EVQLEESGTELARPGASVKLSCKASGYIFSMAWGTWIKQRPGQGLEWIGESYPGAPDTRYTQCKAGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCAGACFQLKSWGLGTTLAVSS.轻链可变区序列氨基酸序列为SEQ.ID.NO.4:DIVITQSPALMAASPGEKVTITCDVCSSITTSYAKWYQQKSGISPKPWIYSYSNLDEGVPARFSGSGSGTSYSLTITSMEAEDAATYYCCCWTDSPAAFGAGTKLELK。此外，本专利技术还提供一种肝癌细胞转移检测用的试剂盒，该试剂盒中含有RRM2B特定蛋白片段的单克隆抗体。有益效果本专利技术通过前期证明的能够用于肝癌细胞转移检测用的RRM2B蛋白密码子进行优化后进行了表达，进而制备相应的单克隆抗体，该抗体能够特异性的结合本专利技术的RRM2B蛋白，并且具有较好的结合能力以及特异性，适宜大规模推广使用。附图说明图1A为密码子优化前序列参数，图1B为密码子优化后的序列参数图2小鼠抗血清效价图图3单克隆抗体腹水效价图图4抗体亚型图具体实施方式下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。实施例1RRM2B特定蛋白片段的表达根据已经证实得与诊断和预后相关的RRM2B蛋白片段的的序列，通过特异性的优化手段进行密码子及GC含量的优化，如图1A和图1B所示，优化后的序列通过调整多种参数后，使得该基因能够表达量得到显著的提高，优化后的序列如SEQIDNO:1所示；设计特异性引物，分别在引物的5’端加入保护性碱基和限制性内切酶，引物序列如下：F:5'-CGCGGATCCATGGGCGACCCGGAAAGGCCGG-3'(SEQ.ID.NO.3)：R:5'-CCGGAATTCTTAAAAATCTGCATCCAAGG-3'(SEQ.ID.NO.4)：以优化后的通过全基因合成的RRM2B基因片段为模板（上海生工合成），用上述特异性引物进行PCR扩增。PCR反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性10sec，56℃退火30sec，65℃延伸1min05s，35个循环；68℃延伸7min，4℃保存。PCR反应体系：2×PCRBuffer12.5μL，2mMdNTPs5μL，10mMRPrimer0.75μL，10mMFPrimer0.75μL，NDNA1μL，dH2O5μL。将扩增产物使用限制性内切酶BamHI和EcoRI和载体pColdI分别进行双酶切，酶切体系为9.5μLPCR产物或载体，0.5μLBamHI，0.5μLEcoRI，8.5μLdH2O。37℃条件下，反应1h。酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，采用Takara公司的琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒回收纯化。采用Takara公司的连接试剂盒DNALigationKit(MightyMix〉将酶切产物RRM2B基因片段、pColdI进行连接，制备重组原核表达载体pCold-RRM2B。RRM2B、pColdI的mol数比约为3:1。16℃，连接1.5小时。将连接产物通过热激转化的方式转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α，37℃过夜培养。选取菌落PCR和酶切鉴定均阳性的阳性质粒进行测序鉴定，经鉴定，所述序列与SEQIDNO：1保持一致。将测序正确的质粒pCold-RRM2B通过热激转化本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种RRM2B基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种RRM2B基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。


2.一种单克隆抗体，其特征在于：其中该抗体的重链可变区氨基酸序列为SEQIDNO：3所示，轻链可变区序列氨基酸序列为SEQIDNO：4。


3....

【专利技术属性】
技术研发人员：彭菲，陈印平，
申请(专利权)人：北京岳昊科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11