一种酯酶及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术提供一种酯酶及其编码基因和应用，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明专利技术通过从南极土壤中筛选克隆获得编码酯酶E31‑4922的基因，通过对其表达蛋白研究发现，其对短链的酯类表现出较强的降解活性，最适pH为7.5，且在7.0‑8.0内稳定存在。最适酶活温度为80℃，且在60‑90℃范围内有保持超过80％的活力。其为热稳定酯酶，对超过60℃的高温环境表现出较高的耐受性。对丰富酯酶家族成员特别是耐高温酯酶家族成员具有重要意义。

An esterase and its coding gene and Application

【技术实现步骤摘要】
一种酯酶及其编码基因和应用
本专利技术属于基因工程和酶工程
，具体涉及一种酯酶及其编码基因和应用。
技术介绍
公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。酯酶(esterases)又称为羧酸酯酶，是一种既可以催化水解酯键又可以催化合成酯键的酶类。在其水解酯键时，会使酯键断裂，产物为酸类和醇类；合成酯键时，会使酸的羧基和醇的羟基脱水缩合，产物为酯类和其他香味物质。酯酶作为一种工业用酶，在工业生产中有着重要的利用价值，可以催化酯交换、酯合成和内酯合成等多种反应，而且反应不需要辅酶、反应条件温和选择性高等优点，因此，酯酶被广泛的应用于食品行业、医药行业、洗涤行业和环保行业等多个行业。酯酶的来源非常广泛，存在于动物、植物和微生物中，尤其在微生物的真菌、细菌和酵母菌中存在居多，其中真菌中有曲霉菌、青霉菌和链孢霉菌等12属23种；细菌中有芽孢杆菌、微球菌和乳酸菌等；酵母类中红酵母和毕赤酵母等。这些产酯酶的微生物分布环境也是多种多样的，如植物油加工场，工厂废弃物等等。目前，有关化学合成制备所需反应物存在诸多的缺点，其制备工艺比较复杂、反应条件特殊、依赖有毒物质且不环保，对资源会形成浪费，成本会增加；用酯酶法进行所需物质的生产，既方便又环保，克服了化学合成步骤中的许多缺点，对产物的生成有一定的针对性。因此，国际上对微生物酶法的运用越来越广泛，与此同时采用生物合成呈香物质的方法成为研究热点。南极土壤的微生物为了适应极端环境而生存，具有特殊的结构、机能及遗传基因。温度等环境因素是影响微生物生存的重要因素，这使得南极土壤成为低温菌资源基地，同时也为获得性质独特，有针对性用途的工业潜力的酯酶提供了巨大的来源。分子生物学、基因组测序技术和宏基因组测序技术的快速发展，大大加快了南极土壤有潜在价值的酯酶的发现与研究，这会使得克隆酯酶基因，庞大有价值的高产基因工程菌的构建，以及后续的工业化生产奠定了坚实的基础。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的目的在于提供一种酯酶及其编码基因和应用。本专利技术通过从南极土壤中筛选克隆获得编码酯酶E31-4922的基因，通过对其表达蛋白研究发现，其对短链的酯类表现出较强的降解活性，最适pH为7.5，且在7.0-8.0内稳定存在。最适酶活温度为80℃，且在60-90℃范围内有保持超过80％的活力。其为热稳定酯酶，对超过60℃的高温环境表现出较高的耐受性。对丰富酯酶家族成员特别是耐高温酯酶家族成员具有重要意义。本专利技术的第一个方面，提供一种酯酶E31-4922，所述酯酶E31-4922是具有如下(a1)或(a2)特征的蛋白质：(a1)其氨基酸序列与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列一致；(a2)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的突变体，该突变体具有与SEQIDNO.1所示的蛋白序列至少90％以上的同源性及至少90％以上的酯酶活性。其中，SEQIDNO.1由299个氨基酸残基组成。本专利技术第二个方面，提供一种编码所述酯酶E31-4922的基因。所述酯酶E31-4922的编码基因从南极土壤中筛选克隆获得。其中，所述基因具有(b1)-(b3)中任一所述核苷酸序列：(b1)SEQIDNO.2所示的核苷酸序列；(b2)与(b1)互补的核苷酸序列；(b3)与(b1)或(b2)所示的核苷酸序列具有≥90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(完全)序列)一致性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。本专利技术的第三个方面，提供一种核酸构建体，其包含与一种或多种调控序列可操作地连接的上述编码基因，所述调控序列在合适的表达宿主中指导所述酯酶的产生。本专利技术的第四个方面，提供一种重组表达载体，其包含上述的核酸构建体。所述的载体为原核表达载体如pET系列载体，pQE系列载体；酵母表达载体pPICZ-α-A，pHIL-D2，pPIC9，pHIL-S1；或动物细胞表达载体pSVK3、pMSG。进一步优选为pET系列载体，如pET22b。本专利技术的第五个方面，提供一种宿主，其由上述重组表达载体经转化或转染原核生物或真核生物宿主得到。所述宿主，其为细菌、酵母或哺乳动物细胞；优选为细菌，进一步优选为大肠杆菌。本专利技术的第六个方面，提供一种生产上述酯酶的方法，其包括：(1)、在有助于产生酯酶的条件下培养上述宿主，其中所述宿主细胞包含SEQIDNO.2所示核苷酸；(2)、回收上述酯酶。本专利技术的第七个方面，提供上述酯酶或上述宿主在水解制备酯类及其衍生物中的应用。所述酯类为短链和中长链酯类，进一步优选为短链酯类，所述短链酯类具体为碳链长度为2～4个碳原子的酯类化合物。上述应用可以在高温环境下进行。所述高温环境为不低于60℃。本专利技术有益技术效果：1、本专利技术所述的南极土壤来源的酯酶E31-4922能高效降解短链的pNP酯类(C2-C4)，具有通过分解转化生成短链潜在的应用价值。2、本专利技术所述的南极土壤来源的酯酶E31-4922在60-90℃和pH7.0-8.0范围内有较高酶活性，且对高温有很高的耐受性，这对高温条件下的工业生产有巨大的应用潜力。附图说明构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。图1、本专利技术实施例2中经过镍柱亲和层析纯化后的纯酯酶E31-4922电泳图，M、蛋白质分子量标记(marker)；图2、本专利技术实施例3中酯酶E31-4922的降解底物活性分析柱状图；图3、本专利技术实施例3中酯酶E31-4922的酶活温度曲线图；其中：(A)温度对酶活性的影响曲线图；(B)温度对酶稳定性的影响曲线图；图4、本专利技术实施例3中酯酶E31-4922的酶活pH曲线图。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本专利技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本专利技术的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本专利技术实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本专利技术的保护范围。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酯酶E31-4922，其特征在于，所述酯酶E31-4922是具有如下(a1)或(a2)特征的蛋白质：/n(a1)其氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列一致；/n(a2)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的突变体，该突变体具有与SEQ ID NO.1所示的蛋白序列至少90％以上的同源性及至少90％以上的酯酶活性。/n

【技术特征摘要】
1.一种酯酶E31-4922，其特征在于，所述酯酶E31-4922是具有如下(a1)或(a2)特征的蛋白质：
(a1)其氨基酸序列与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列一致；
(a2)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的突变体，该突变体具有与SEQIDNO.1所示的蛋白序列至少90％以上的同源性及至少90％以上的酯酶活性。


2.一种编码所述酯酶E31-4922的基因。


3.如权利要求2所述基因，其特征在于，所述基因具有(b1)-(b3)中任一所述核苷酸序列：
(b1)SEQIDNO.2所示的核苷酸序列；
(b2)与(b1)互补的核苷酸序列；
(b3)与(b1)或(b2)所示的核苷酸序列具有≥90％一致性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。


4.一种核酸构建体，其特征在于，其包含与一种或多种调控序列可操作地连接的权利要求2或3所述基因，所述调控序列在表达宿主中指导所述酯酶的产生。


5.一种重组表达载体，其特征在于，其包含权利要求4所述的核酸构建体。


6.如权利要求5所述的重组表达载...

【专利技术属性】
技术研发人员：周明扬，刘健敏，邢澍，刘文杰，刘晓雨，武涛，吴汉夔，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37