一种从尿液中提取多种尿蛋白的方法技术

本发明专利技术提供一种从尿液中提取多种尿蛋白的方法，所述方法利用特定吸附剂对尿液中多种蛋白质的同时亲和捕获与从吸附剂上的分阶段特定洗脱，包括以下步骤：1)收集尿液，进行透析、离心和过滤；2)制备Cibacron Blue F3‑GA‑琼脂糖凝胶亲和吸附剂，装柱并平衡；3)将尿液上样，静置；4)分阶段洗脱，收集各个阶段的洗脱级分。本发明专利技术的方法能够从同一批尿液中平行地一次提取出不少于八种高价值的尿蛋白，显著提高了尿蛋白的分离提取效率，使尿液作为特定生物资源得到充分利用。

A method of extracting various urinary proteins from urine

【技术实现步骤摘要】
一种从尿液中提取多种尿蛋白的方法
本专利技术涉及蛋白提取技术，更具体而言，本专利技术涉及一种从尿液中提取多种尿蛋白的方法。
技术介绍
一个健康成人每天排出体外的尿液平均为1.5升，因此城市每天(24小时)排出体外的尿液量是非常巨大的数字，而人类的尿液里含有多达1500余种蛋白质，其中很多蛋白质有相当高的科研、医疗和经济价值。因此，如果能从人尿液中分离提取并纯化尿蛋白，经济价值将相当可观；并且，处理后的尿液残渣还可以作为农业有机肥料使用，变废为宝，同时还解决了尿液产生的环境问题。现在从人尿液中分离提取的尿蛋白一般仅限于四种：尿激酶、人尿胰蛋白酶抑制剂乌司他丁、白蛋白和β2-微球蛋白，另有少数企业能够从孕妇的尿液中分离提取出人绒毛膜促性腺激素(简称hCG)，但是限于原料不易获取，所以生产成本较高。目前已知的从尿液中分离提取尿蛋白的生产工艺都只能从一批尿液中同时提取出最多两种蛋白质，一般仅能够从同一批尿液中分离提取出一种尿蛋白；并且，这些生产工艺往往粗制和精制合一，纯化一种尿蛋白只能从头做到底，没有选择的余地，不能根据市场的要求有效、灵活地调整生产的具体产品的类型和产量。因此，本领域仍需要能够从尿液中同时提取多种尿蛋白的方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，提供一种从尿液中提取多种蛋白质的方法，特别是该方法能够从同一批次尿液中吸附和洗脱出多种尿蛋白，从而使尿液作为特定生物资源得到充分利用；同时，考虑到获取的尿蛋白的多样性和专一性之间的关系，该方法还能够通过限制吸附的尿蛋白的数量，使得洗脱液中所包含的不同种类的尿蛋白数量适当，容易用分子筛层析或离子交换层析加以分离为单一种类的尿蛋白，为最终的精制提供很有价值的基础。为了解决上述技术问题，本专利技术的专利技术人提供一种从尿液中提取多种尿蛋白的方法，该方法主要利用特定吸附剂对尿液中多种蛋白质的同时亲和捕获与从吸附剂上的分阶段特定洗脱。具体而言，本专利技术的方法包括以下步骤：1)收集尿液，进行透析、离心和过滤；2)制备CibacronBlueF3-GA-琼脂糖凝胶亲和吸附剂，装柱并平衡；3)将尿液在亲和层析柱上样，上样后在室温下静置；4)分阶段洗脱，收集各个阶段的洗脱级分。根据本专利技术的方法，步骤1)中，所述尿液为哺乳动物尿液，优选为人的尿液；根据本专利技术的具体实施方式，从可建立有特殊的收集装置的公共厕所收集人排出体外的尿液，对所述尿液进行过滤，所述过滤采用10nm≤孔径≤15nm的纳滤膜进行，或者所述过滤先采用20nm≤孔径的超滤膜进行，然后再采用10nm≤孔径≤15nm的纳滤膜进行。步骤1)中，所述透析可以是自由扩散透析或搅拌透析，例如参见余瑞元等人，《生物化学实验原理与方法》，北京大学出版社，2005，第二版。根据本专利技术的方法，优选地，所述透析包括以1-2倍体积的缓冲溶液对尿液透析过夜或透析6-8hr，其中所述缓冲溶液为50mMKH2PO4/K2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)、20mMNaH2PO4/Na2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)或10mMTris-HCl缓冲溶液(pH＝7.5-8.0)；优选地，所述透析先在水中透析过夜，然后在所述缓冲溶液中透析过夜。接下来，需要对经透析的尿液进行离心和过滤处理。根据本专利技术的方法，步骤1)中，所述离心包括：将透析液在10,000g-12,000g的重力下离心40min-60min；优选地，所述过滤包括取离心得到的上清液，经0.22μm滤器过滤。根据本专利技术的方法，需要准备亲和层析介质。本专利技术的方法采用CibacronBlueF3-GA作为亲和配体，琼脂糖凝胶(例如Sepharose4B)作为载体，二者偶联得到亲和吸附剂进行装柱。因此，步骤2)中，所述CibacronBlueF3-GA-琼脂糖凝胶亲和吸附剂通过偶联CibacronBlueF3-GA和琼脂糖凝胶例如Sepharose4B制备得到；优选地，所述制备CibacronBlueF3-GA-琼脂糖凝胶亲和吸附剂包括以下步骤：A.水洗得到湿琼脂糖凝胶4B，并在室温下分散在体积为干胶体积至少十倍的水中，混匀；B.将CibacronBlueF3-GA在室温下溶解于至少十倍体积的水中，混匀；C.在温和搅拌下，使CibacronBlueF3-GA与湿琼脂糖凝胶以1:100的质量比充分混合；D.加入20％氯化钠溶液，室温下放置30min，再加入15％碳酸钠溶液，室温下偶联1h，得到亲和吸附剂；E.用10-30℃、优选20-25℃的水、6M尿素和1％碳酸钠溶液依次洗涤亲和吸附剂，直至洗涤液无色。备选地，也可以采用CibacronBlueF3-GA与CNBr活化琼脂糖凝胶4B偶联制备亲和吸附剂。采用本领域常规方法将得到的亲和吸附剂装柱。优选地，步骤2)中，所述装柱得到柱体积为10-25ml、优选10ml的亲和层析柱。在上样前，需要进行亲和层析柱的平衡操作。根据本专利技术的方法，所述平衡中，以20mMNaH2PO4/Na2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)、50mMKH2PO4/K2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)或10mMTris-HCl缓冲溶液(pH＝7.5-8.0)作为平衡缓冲溶液，以1-3ml/min的流速冲洗亲和层析柱；进一步优选地，所述平衡中采用至少3倍柱体积的平衡缓冲溶液。根据本专利技术的方法，亲和层析柱连接上检测器，选择280nm的检测波长，在亲和柱平衡完成后(观察电导和pH的数值变化趋势)，进行该柱的上样。其中，步骤3)中，所述上样包括将经步骤1)得到的尿液以1-3ml/min的流速流过步骤2)中制备的亲和层析柱；优选地，所述尿液的体积为亲和层析柱中的亲和层析介质的体积的2-6倍、优选2.5-3倍。上样后，静置一段时间而不是立刻洗脱能够提高吸附效率。优选地，所述静置包括在室温下静置30min-1hr。根据本专利技术的方法，采用分阶段洗脱来获得尿液中的多种蛋白质。其中，步骤4)中，所述分阶段洗脱包括采用磷酸钾缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液的第一阶段洗脱、采用包含NaCl的磷酸钾缓冲溶液、磷酸钠缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液的第二阶段洗脱和采用包含NaSCN的磷酸钾缓冲溶液、磷酸钠缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液的第三阶段洗脱；优选地，所述第一阶段洗脱包括：以50mMKH2PO4/K2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)或10mMTris-HCl缓冲溶液(pH＝7.5-8.0)作为洗脱缓冲溶液，以1-3ml/min的流速冲洗亲和层析柱；优选地，将50mMKH2PO4/K2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)作为洗脱缓冲溶液；优选地，所述第一阶段洗脱中采用5-15倍柱体积的洗脱缓冲溶液。优选地，所述步骤1)的透析中使用的缓冲溶液和/或所述步骤2)的平衡中使用的缓冲溶液与第一阶段洗脱中采用的洗脱缓冲溶液相同。这一阶段的洗脱能够监本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从尿液中提取多种尿蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：/n1)收集尿液，进行透析、离心和过滤；/n2)制备Cibacron Blue F3-GA-琼脂糖凝胶亲和吸附剂，装柱并平衡；/n3)将尿液在亲和层析柱上样，上样后在室温下静置；/n4)分阶段洗脱，收集各个阶段的洗脱组分。/n

【技术特征摘要】
1.一种从尿液中提取多种尿蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
1)收集尿液，进行透析、离心和过滤；
2)制备CibacronBlueF3-GA-琼脂糖凝胶亲和吸附剂，装柱并平衡；
3)将尿液在亲和层析柱上样，上样后在室温下静置；
4)分阶段洗脱，收集各个阶段的洗脱组分。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述尿液为哺乳动物尿液，优选为人的尿液；优选地，所述尿液为从公共厕所收集的人排出体外的尿液，对所述尿液进行过滤，所述过滤采用10nm≤孔径≤15nm的纳滤膜进行，或者所述过滤先采用20nm≤孔径的超滤膜进行，然后再采用10nm≤孔径≤15nm的纳滤膜进行；
优选地，所述透析为自由扩散透析或搅拌透析，包括以1-2倍体积的缓冲溶液对尿液透析过夜或透析6-8hr，其中所述缓冲溶液为50mMKH2PO4/K2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)、20mMNaH2PO4/Na2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)或10mMTris-HCl缓冲溶液(pH＝7.5-8.0)；
优选地，所述透析先在水中透析过夜，然后在所述缓冲溶液中透析过夜。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述离心包括：将透析液在10,000g-12,000g的重力下离心40min-60min；
优选地，所述过滤包括取离心得到的上清液，经0.22μm滤器过滤。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述CibacronBlueF3-GA-琼脂糖凝胶亲和吸附剂通过偶联CibacronBlueF3-GA和琼脂糖凝胶例如Sepharose4B制备得到；
优选地，所述制备CibacronBlueF3-GA-琼脂糖凝胶亲和吸附剂包括以下步骤：
A.水洗得到湿琼脂糖凝胶，并在室温下分散在体积为干胶体积至少十倍的水中，混匀；
B.将CibacronBlueF3-GA在室温下溶解于至少十倍体积的水中，混匀；
C.在温和搅拌下，使CibacronBlueF3-GA与湿琼脂糖凝胶以1:100的质量比充分混合；
D.加入20％氯化钠溶液，室温下放置30min，再加入15％碳酸钠溶液，室温下偶联1h，得到亲和吸附剂；
E.用10-30℃、优选20-25℃的水、6M尿素和1％碳酸钠溶液依次洗涤亲和吸附剂，直至洗涤液无色。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述装柱得到柱体积为10-25ml、优选10ml的亲和层析柱；
优选地，所述平衡中，以20mMNaH2PO4/Na2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)、50mMKH2PO4/K2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)或10mMTris-HCl缓冲溶液(pH＝7.5-8.0)作为平衡缓冲溶液，以1-3ml/min的流速冲洗亲和层析柱；
优选地，所述平衡中采用至少3倍柱体积的平衡缓冲溶液。


6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述上样包括将经步骤1)得到的尿液以1-3ml/min的流速流过步骤2)中制备的亲和层析柱；
优选地，所述尿液的体积为亲和层析柱中的亲和层析介质的体积的2-6倍、优选2.5-3倍；
优选地，所述静置包括在室温下静...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈彦涌，方学敏，
申请(专利权)人：北京聚德方辉科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11