一种肝片吸虫假定蛋白基因及胶体金免疫层析试纸制造技术

本发明专利技术公开一种肝片吸虫假定蛋白基因，同时还提供了利用肝片吸虫假定蛋白基因制成的胶体金免疫层析试纸，利用肝片吸虫假定蛋白制成肝片吸虫感染检测胶体金试纸条，具有简便、易操作、具有高灵敏性、高特异性、时间短等特点，结果清晰可见，适用于临床现场检测和大规模的流行病学调查。

A hypothetical protein gene of Fasciola hepatica and colloidal gold immunochromatographic test paper

【技术实现步骤摘要】
一种肝片吸虫假定蛋白基因及胶体金免疫层析试纸
本专利技术公开一种肝片吸虫假定蛋白基因，同时还提供了利用肝片吸虫假定蛋白基因制成的胶体金免疫层析试纸，用于牛羊肝片吸虫感染的血清检测，属于免疫学

技术介绍
肝片吸虫寄生在牛、羊等反刍动物的肝脏和胆管内，引起宿主急性或慢性的肝炎和胆管炎的人畜共患寄生虫病。该病呈世界性分布，常呈地方性流行，多雨年份能促进本病的流行严重威胁人畜的健康，并对畜牧业的发展造成阻碍。肝片吸虫病的检测常规方法是检查粪便中是否含有肝片吸虫幼虫来确诊，在实践应用中有诸多不方便之处，目前，缺乏简便、快速的肝片吸虫病免疫诊断方法。
技术实现思路
本专利技术提供一种肝片吸虫假定蛋白基因（HypotheticalproteinD915_11650基因），是利用羊肝片吸虫阳性血清对肝片吸虫cDNA文库进行筛选得到的，大小为1005bp，在核苷酸同源性分析中未发现与其同源的基因，是一个新基因。本专利技术进一步提供了肝片吸虫假定蛋白基因制成的胶体金免疫层析试纸，具有快速便捷、操作简单、不需要特殊仪器等特点，适合临床现场检测及大规模流行病学调查。本专利技术所说的一种肝片吸虫假定蛋白基因（HypotheticalproteinD915_11650基因），其特征在于：基因序列如SEQNo.1所示。用于扩增肝片吸虫假定蛋白基因的nest-PCR扩增引物，具有以下序列：F:5’-CGAGCTCATGGTTCTTGCTGAGGAACGACAG-3’R:5’-CCCAAGCTTTCAACTGACCATATCACCGAGATC-3’。本专利技术所述的一种肝片吸虫假定蛋白基因制备方法，包括以下步骤：1）λ噬菌体插入基因的克隆插入基因片段扩增引物序列由上海生工合成，如下：F：5'-CTCGGGAAGCGCGCCATTGTGTTGGT-3'；R：5'-ATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGCC-3'；2）开放性阅读框PCR扩增根据开放性阅读框基因序列，用Primer5.0软件进行引物设计，限制性内切酶分别为SacI、HindⅢ：F:5’-CGAGCTCATGGTTCTTGCTGAGGAACGACAG-3’；R:5’-CCCAAGCTTTCAACTGACCATATCACCGAGATC-3’；以肝片吸虫假定蛋白D915_11650基因扩增产物为模板进行开放性阅读框的PCR扩增3）肝片吸虫假定蛋白D915_11650基因克隆载体构建将目的片段与pMD-18T载体连接，连接产物转化入感受态，对重组质粒进行鉴定以及双酶切鉴定；4）肝片吸虫假定蛋白D915_11650表达载体构建目的基因基因与pET-28a质粒连接，连接产物转化入感受态，并进行双酶切验证。本专利技术提供的一种检测肝片吸虫感染胶体金免疫层析试纸条，主要包括玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜、吸水纸、PVC底板；其特征在于：金标垫上的金标抗体为金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA），硝酸纤维素膜上的指示线T线包被肝片吸虫假定蛋白D915_11650、C线包被兔抗SPA抗体。本专利技术所述的一种检测肝片吸虫感染胶体金免疫层析试纸条制备方法，通过克隆、表达纯化肝片吸虫假定蛋白D915_11650重组蛋白，利用柠檬酸三钠还原法烧制胶体金溶液，之后利用胶体金对金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）抗体进行标记，制备金标垫，组装试纸条，肝片吸虫假定基因D915_11650蛋白作为检测线、兔抗SPA抗体作为质检线，步骤如下：1）胶体金的烧制利用柠檬酸三钠还原法，向99mLddH2O中加入1mL1%氯金酸，沸腾后加入1mL1%柠檬酸三钠，制备40nm胶体金颗粒；2）金标抗体pH确定利用K2CO3梯度标记法，确定金标最佳pH，0.2mol/LK2CO3加入量为2µL；3）金标抗体的制备利用摸索好的最佳K2CO3加入量通过胶体金对SPA进行标记，标记后的金标抗体溶解于复溶液中4℃保存待用或直接滴加于金标垫上；4）NC膜上T线假定蛋白D915_11650蛋白包被浓度的确定将T线假定蛋白D915_11650蛋白稀释成2、1、0.5、0.25、0.125mg/mL，每个试纸条包被1µL，按照常规条件进行操作，观察结果T线的显色情况，确定T线多抗的最佳包被浓度1mg/mL；5）NC膜上C线兔抗SPA抗体包被浓度的确定将C线兔抗SPA抗体稀释成2、1、0.5、0.25、0.125mg/mL，每个试纸条包被1µL，按照常规条件进行操作，观察结果C线的显色情况，确定0.5mg/mL为C线最佳包被浓度。本专利技术经原核表达可得到36kDa左右的蛋白条带，经Westernblot检测该蛋白具有良好的反应原性，可作为检测肝片吸虫的诊断性抗原。本专利技术的积极效果在于：公开了一种肝片吸虫假定蛋白基因，并利用肝片吸虫假定蛋白制成肝片吸虫感染检测胶体金试纸条，具有简便、易操作、具有高灵敏性、高特异性、时间短等特点，结果清晰可见，适用于临床现场检测和大规模的流行病学调查。附图说明图1为透射电镜观察金颗粒；图2为透射电镜观察金标探针；图3为特异性试验结果图；图4为敏感性试验结果图。具体实施方式下列实施例旨在进一步举例说明，而不是限制本专利技术。本领域技术人员可以理解到，在不背离本专利技术的精神和原则的前提下，对本专利技术的任何平行改变和改动都将落入本专利技术的待批权利要求范围内。实施例1一、肝片吸虫假定蛋白D915_11650重组蛋白基因的克隆、表达1、λ噬菌体插入基因的克隆插入基因片段扩增引物序列由上海生工合成，如下：F：5'-CTCGGGAAGCGCGCCATTGTGTTGGT-3'；R：5'-ATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGCC-3'；2、开放性阅读框PCR扩增根据开放性阅读框基因序列，用Primer5.0软件进行引物设计，限制性内切酶分别为SacI、HindⅢ：F:5’-CGAGCTCATGGTTCTTGCTGAGGAACGACAG-3’；R:5’-CCCAAGCTTTCAACTGACCATATCACCGAGATC-3’；以肝片吸虫假定蛋白D915_11650基因扩增产物为模板进行开放性阅读框的PCR扩增3、肝片吸虫假定蛋白D915_11650基因克隆载体构建将目的片段与pMD-18T载体连接，连接产物转化入感受态，对重组质粒进行鉴定以及双酶切鉴定。4、肝片吸虫假定蛋白D915_11650表达载体构建目的基因基因与pET-28a质粒连接，连接产物转化入感受态，并进行双酶切验证；基因序列如SEQNo.1所示。实施例2肝片吸虫感染检测胶体金试纸条的制备1、方法（1）胶体金的烧本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肝片吸虫假定蛋白基因（Hypothetical protein D915_11650基因），其特征在于：/n基因序列如SEQ No.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种肝片吸虫假定蛋白基因（HypotheticalproteinD915_11650基因），其特征在于：
基因序列如SEQNo.1所示。


2.用于扩增权利要求1所述的肝片吸虫假定蛋白基因的nest-PCR扩增引物，具有以下序列：
F:5’-CGAGCTCATGGTTCTTGCTGAGGAACGACAG-3’
R:5’-CCCAAGCTTTCAACTGACCATATCACCGAGATC-3’。


3.如权利要求1所述的一种肝片吸虫假定蛋白基因制备方法，包括以下步骤：
1）λ噬菌体插入基因的克隆
插入基因片段扩增引物序列由上海生工合成，如下：
F：5'-CTCGGGAAGCGCGCCATTGTGTTGGT-3'；
R：5'-ATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGCC-3'；
2）开放性阅读框PCR扩增
根据开放性阅读框基因序列，用Primer5.0软件进行引物设计，限制性内切酶分别为SacI、HindⅢ：
F:5’-CGAGCTCATGGTTCTTGCTGAGGAACGACAG-3’；
R:5’-CCCAAGCTTTCAACTGACCATATCACCGAGATC-3’；
以肝片吸虫假定蛋白D915_11650基因扩增产物为模板进行开放性阅读框的PCR扩增
3）肝片吸虫假定蛋白D915_11650基因克隆载体构建
将目的片段与pMD-18T载体连接，连接产物转化入感受态，对重组质粒进行鉴定以及双酶切鉴定；
4）肝片吸虫假定蛋白D915_11650表达载体构建
目的基因基因与pET-28a质粒连接，连接产物转化入感受态，并进行双酶切验证。


4.一种检测肝片吸虫感染胶体...

【专利技术属性】
技术研发人员：李建华，刘天，张西臣，宫鹏涛，李新，杨举，李赫，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22