一组桑树细菌性枯萎病病原克雷伯氏菌的PCR检测引物及应用制造技术

本发明专利技术公开了一组桑树细菌性枯萎病病原克雷伯氏菌的PCR检测引物及应用，本发明专利技术根据桑树细菌性枯萎病病原克雷伯氏菌设计了一组克雷伯氏菌的PCR检测引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示，其能够用于感染桑细菌性枯萎病病原菌克雷伯氏菌的病株及根际土壤样本的检测，具有很好的检测效果，这对于这对桑园桑树病害中桑细菌性枯萎病病原菌克雷伯氏菌的快速检测具有重要意义，有很好的应用价值，值得推广。

PCR primers for detection of Klebsiella pneumoniae as pathogen of bacterial wilt of mulberry and their application

【技术实现步骤摘要】
一组桑树细菌性枯萎病病原克雷伯氏菌的PCR检测引物及应用
本专利技术涉及植物病害检测
，更具体地，涉及一组桑树细菌性枯萎病病原克雷伯氏菌的PCR检测引物及应用。
技术介绍
桑在蚕桑产业发展和变革中，有着基础性的地位，起着先导性的作用。随着桑产业的转型，在桑树资源的综合利用及桑树产业的不断开发和桑全基因组测序完成，全面开展功能基因研究的背景下，桑树的基础研究将成为桑产业发展和创新的重要支撑。桑枯萎病作为最重要的桑树细菌病害之一，在我国浙江及华南蚕区发生较普遍且危害严重。该病对桑叶的产量影响非常大，严重阻碍蚕桑业发展。桑树细菌性枯萎病病害特征较为典型，其为全株性病害，发病初期，上部分枝条枯萎褐化，叶片外缘先开始失水翻卷，随后，自上而下整株枯萎并开始脱落。剖开病株的茎、根的表皮，木质部有不同程度的黄化，褐化现象，产生褐色条纹，严重时木质部周身变褐变黑，根部腐烂。桑细菌性枯萎病是一种典型的毁灭性突出病害，其病原多样化，包括肠杆菌属的阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、阿氏肠杆菌(Enterobacterasburiae)、桑肠杆菌(Enterobactermori.)三种病原，克雷伯氏杆菌属(Klebsiella)的肺炎杆菌(K.pneumoniae)、克雷伯氏菌(K.variicola)、产酸克雷伯氏菌(K.Oxytoca)三种病原以及泛菌属(Pantoea)的菠萝泛菌(Pantoeaananatis)病原。目前只对桑肠杆菌(E.mori)和阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)，及菠萝泛菌(Pantoeaananatis)建立了分子检测方法，而桑枯萎病病原之一的克雷伯氏菌(Klebsiella)尚未建立相应的检测方法，严重影响了病害检疫及防治。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术没有针对引起桑树细菌性枯萎病的克雷伯氏菌的检测方法不足，提供一组桑树细菌性枯萎病克雷伯氏菌PCR检测引物及应用。本专利技术的第一个目的是提供一组克雷伯氏菌的PCR检测引物。本专利技术的第二个目的是提供所述PCR检测引物在克雷伯氏菌和/或桑树细菌性枯萎病的检测中的应用。本专利技术的第三个目的是提供所述PCR检测引物在制备克雷伯氏菌和/或桑树细菌性枯萎病的检测试剂盒中的应用。本专利技术的第四个目的是提供一种克雷伯氏菌的检测试剂盒。本专利技术的第五个目的是提供一种克雷伯氏菌的检测方法。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案予以实现的：本专利技术要求保护一组克雷伯氏菌的PCR检测引物，其核苷酸序列如SEQIDNO：1～2所示。SEQIDNO：1：ATTGCGTAGAAGAGCCTGAA；SEQIDNO：2：CAGGACACGCAGTTAAGACC。本专利技术还要求保护以下内容：所述PCR检测引物在克雷伯氏菌和/或桑树细菌性枯萎病的检测中的应用。所述PCR检测引物在制备克雷伯氏菌和/或桑树细菌性枯萎病的检测试剂盒中的应用。进一步本专利技术要求一种克雷伯氏菌的检测试剂盒，包括所述检测引物。优选地，还包括PCR反应的试剂。优选地，所述PCR反应的试剂为2×TaqMasterMix和ddH2O。更优选地，所述检测试剂盒，PCR反应的体系为2×TaqMasterMix10μL，核苷酸序列如SEQIDNO：1～2所示引物(10μM)各0.5μL，待测样本DNA2μL，ddH2O补足20μL。更优选地，所述检测试剂盒，PCR反应的程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，退火30s，退火温度为53.0℃，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。最优选地，本专利技术提供一种克雷伯氏菌的检测试剂盒：一、组成以上所述检测引物、2×TaqMasterMix和ddH2O；二、使用方法1、PCR扩增PCR反应的体系为2×TaqMasterMix10μL，核苷酸序列如SEQIDNO：1～2所示引物(10μM)各0.5μL，待测样本DNA2μL，ddH2O补足20μL；PCR反应的程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，退火30s，退火温度为53℃，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min；2、结果判读PCR扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳检测，920bp左右处有扩增条带(核苷酸序列如SEQIDNO：3所示)，则说明待测样本含有桑细菌性枯萎病病原克雷伯氏菌，否则不含有桑细菌性枯萎病病原克雷伯氏菌。本专利技术还求保护一种克雷伯氏菌的检测方法，利用所述检测引物进行PCR扩增。优选地，PCR扩增退火温度为48～59℃。更优选地，PCR扩增退火温度为53.0℃。更优选地，PCR扩增的体系为2×TaqMasterMix10μL，核苷酸序列如SEQIDNO：1～2所示引物(10μM)各0.5μL，待测样本DNA2μL，ddH2O补足20μL。更优选地，PCR扩增的程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，退火30s，退火温度为53℃，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。优选地，扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳检测，926bp处有扩增条带，则说明待测样本含有桑细菌性枯萎病病原克雷伯氏菌，否则不含有桑细菌性枯萎病病原克雷伯氏菌。更优选地，扩增条带核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术得到的得到一组针对克雷伯氏菌的具有很好的特异性和灵敏性的引物，其能够用于感染桑细菌性枯萎病病原菌克雷伯氏菌的病株及根际土壤样本的检测，具有很好的检测效果，这对于这对桑园桑树病害中桑细菌性枯萎病病原菌克雷伯氏菌的快速检测具有重要意义，有很好的应用价值，值得推广。附图说明图1为引物温度优化图；M为2000bp的Mark；泳道1退火温度为48℃；泳道2退火温度为49℃；泳道3退火温度为50℃；泳道4退火温度为51℃；泳道5退火温度为52℃；泳道6退火温度为53℃；泳道7退火温度为54℃；泳道8退火温度为55℃；泳道9退火温度为56℃；泳道10退火温度为57℃；泳道11退火温度为58℃；泳道12退火温度为59℃。图2为引物组KL-F1/KL-R1的特异性测定：泳道1克雷伯氏菌(Klebsiellasp)、泳道2为阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、泳道3为菠萝菠萝泛菌(Pantoeaananatis)、泳道4固氮菌(Kosakoniasp)、泳道5为假单胞菌(Pseudomonassp)、泳道6为多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)、泳道7为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、泳道8为短小杆菌(Curtobacteriumsp)、泳道9茄科劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)、泳道10沙雷氏菌(Serratiamarcescen本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一组克雷伯氏菌的PCR检测引物，其特征在于，其核苷酸序列如IID NO：1～2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一组克雷伯氏菌的PCR检测引物，其特征在于，其核苷酸序列如IIDNO：1～2所示。


2.权利要求1所述PCR检测引物在克雷伯氏菌和/或桑树细菌性枯萎病的检测中的应用。


3.权利要求1所述PCR检测引物在制备克雷伯氏菌和/或桑树细菌性枯萎病的检测试剂盒中的应用。


4.一种克雷伯氏菌的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述检测引物。


5.根据权利要求4所述检测试剂盒...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘吉平，罗龙辉，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44