一种一日龄鉴别鸡受精蛋性别的方法技术

本发明专利技术公开了一种一日龄鉴别鸡受精蛋性别的方法，包括以下步骤：在鸡Z染色体上定点插入标签蛋白基因，并构建基因型为携带标签蛋白基因插入片段纯合子的纯系，再通过纯系与野生型个体进行配套组合，所生的种蛋入孵第一天通过光学设备照射就可判断种蛋的性别。本发明专利技术的鉴定方法能够在受精蛋入孵后一天内即可准确判断受精蛋性别，既能保证母雏的正常生产，也不会对雄性种蛋造成浪费的技术，该方法方便快捷、价格低廉，适于推广与应用。

A method to identify the sex of fertilized eggs in one day old chickens

【技术实现步骤摘要】
一种一日龄鉴别鸡受精蛋性别的方法
本专利技术涉及生物
，特别涉及一种一日龄鉴别鸡受精蛋性别的方法。
技术介绍
家鸡受精蛋早期胚胎性别鉴定一直是行业难点。主要原因在于禽类胚胎发育有其区别于哺乳动物的特点：禽类胚胎发育分为体内和体外两个阶段，精卵结合后且仅在体内停留20～26小时左右即以蛋的形式娩出，并暂停发育，该阶段胚胎处于囊胚阶段，尚未有技术能够检测母鸡体内胚胎性别；受精蛋娩出后，适宜的温度下开始继续发育，此时受精卵外部有厚厚的蛋白，蛋白外部为结实的蛋壳，传统孵化技术通过“照蛋”只能分辨出是否为受精蛋，胚胎是否死亡，无法分辨性别。目前常用的雌雄鉴别技术主要分为两类：一类是出雏后，通过一些伴性性状如“金银羽”、“快慢羽”和“横斑”等性状可在雏鸡出壳后24小时内实现快速鉴别雌雄，准确率超过95％。尽管该技术一定程度上满足了蛋鸡商品代养殖的需求，但是和母鸡等量的公鸡则被立即屠杀，造成很大了浪费和人道主义困扰。该技术的实施需要培育专门化品系(如慢羽系等)，需要通过特殊杂交配套组合才能实现，无法直接通过本品种选育实现雌雄自别。另一类技术是直接对处于孵化阶段的受精蛋进行操作，判断性别。典型方法如光谱扫描，利用不同性别胚胎生理生化指标如：血红蛋白浓度等成分浓度不同，实现胚胎早期性别鉴定，该方法需要胚胎至少发育到7天以后(即胚胎性别分化到足够程度)才能实现。利用穿刺技术，提取胚胎内部分组织液，通过PCR(聚合酶链式反应)，可以鉴别胚胎染色体组成，从而判断性别。即便在胚胎孵化7天后判断出受精蛋性别，已经入孵一周多的种蛋也无法另做他用，造成资源浪费。同时该类技术均需破坏蛋壳，无法实现工业化生产。因此，需要一种能够在胚胎发育早期(如入孵后一天内)即可准确判断受精蛋性别的技术，既能保证母雏的正常生产，也不会对雄性种蛋造成浪费的技术，以克服现有技术存在的缺陷。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。本专利技术还有一个目的是提供一种一日龄鉴别鸡受精蛋性别的方法，能够在受精蛋入孵后一天内即可准确判断受精蛋性别，既能保证母雏的正常生产，也不会对雄性种蛋造成浪费的技术，该方法方便快捷、价格低廉，适于推广与应用。为了实现本专利技术的这些目的和其它优点，提供了一种一日龄鉴别鸡受精蛋性别的方法，包括以下步骤：在鸡Z染色体上定点插入标签蛋白基因，并构建基因型为携带标签蛋白基因插入片段纯合子的纯系，再通过纯系与野生型个体进行配套组合，所生的种蛋入孵第一天通过光学设备照射就可判断种蛋的性别。优选的是，所述标签蛋白基因为Z染色体上定点位置插入可用于早期鉴别且可被检测到的标记基因。优选的是，所述标签蛋白基因为绿色荧光蛋白基因。优选的是，构建基因型为携带绿色荧光蛋白基因插入片段纯合子的纯系，具体包括以下的方法步骤：步骤1：根据禽类Z染色体基因组序列，设计引导RNA序列；步骤2：通过分子克隆，将引导RNA序列插入到含有xCAS9蛋白的AAV-CRISPR质粒的多克隆位点上，构建CRISPR/CAS基因切割质粒；步骤3：根据Z染色体上插入位点获取靶序列，再根据靶序列上下游1kb的基因序列分别扩增上游同源臂序列如SEQIDNO:1所示和下游同源臂序列如SEQIDNO:2所示，将上游同源臂序列和下游同源臂序列通过分子克隆与绿色荧光蛋白基因连接，形成供体基因序列，并将供体基因序列克隆到AAV质粒中，构建CRISPR/CAS基因供体质粒；步骤4：将构建好的CRISPR/CAS基因切割质粒和CRISPR/CAS基因供体质粒分别进行AVV病毒包装，得到两种病毒原液，再分别经纯化、浓缩后得到两种工作液病毒；步骤5：将得到的两种工作液病毒共同注射到早期的鸡受精卵的胚盘中，并进行孵化；、步骤6：孵化后得到的仔鸡F0代，通过表型和PCR扩增检测进行阳性鉴定；将阳性的F0代鸡与野生型鸡配种，并通过阳性鉴定方法，得到具有外源基因遗传能力的杂合子F1代鸡；；步骤7：将步骤6中的F1代阳性杂合子公鸡和阳性母鸡纯繁产生的雏鸡，通过阳性鉴定方法，得到公鸡和母鸡均为基因修饰的纯合个体。优选的是，步骤1中所述引导RNA序列具体设计方式为：通过在位于Z染色体上75842691-75842693bp上找到合适的PAM位点，并获得该位点附近20-24bp的靶序列，然后将靶序列和tracerRNA序列融合而成。优选的是，步骤4中所述工作液病毒的滴度不小于1012vg/mL。优选的是，步骤5中注射的位置为：在待注射种蛋平置并标记长轴和短轴的交点，酒精消毒后在交点处开窗，并找到胚盘上方的明区。优选的是，步骤5中所述工作液病毒的注射体积为0.5-2μL。优选的是，步骤6和步骤7中阳性鉴定时，PCR扩增检测的条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s-60℃退火30s-72℃延伸30s，循环25次；72℃延伸5min；4℃保存。优选的是，所述纯系与野生型个体进行配套组合，具体配套组合形式为：不携带绿色荧光蛋白的野生型公鸡和步骤7中筛选出的携带绿色荧光蛋白的母鸡交配，所产生的种蛋依据有无绿色荧光判断雌雄，能检测到绿色荧光反应的为雄性种蛋，不能检测到绿色荧光反应的雌性种蛋。优选的是，所述光学设备是能以波长395nm的紫外光或450-490nm的蓝光作为激发光照射种蛋的设备。本专利技术至少包括以下有益效果：本专利技术利用基因编辑技术，将绿色荧光蛋白基因插入鸡性染色体Z，并构建基因型均为携带绿色荧光蛋白插入片段纯合子的纯系。通过该纯系与野生型个体进行配套组合，其种蛋入孵第一天即可准确判断种蛋性别：雌性种蛋不携带绿色荧光蛋白基因可用于大规模蛋鸡生产，携带插入基因的雄性种蛋可用作生物反应器等用途。相较于其他胚胎性别鉴定方法，本专利技术胚胎雌性鉴定在种蛋入孵第一天完成，准确性高，该方法不破坏蛋壳，对种蛋应激小，并且早期性别鉴定后的胚胎可及时处理，避免浪费孵化资源。本专利技术的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本专利技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。附图说明图1为本专利技术所述的F0代基因修饰动物基因型鉴定结果，泳道从左到右分别为WT(未经修饰的野生型基因)、雄性杂合、雄性纯合、雌性阳性，Marker最小为200bp，Marker最亮条带为1000bp；图2为所述的构建得到的纯系和野生型个体配套组合形式。具体实施方式下面对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。本专利技术提供一种一日龄鉴别鸡受精蛋性别的方法，包括以下步骤：在鸡Z染色体上定点插入标签蛋白基因，并构建基因型为携带标签蛋白基因插入片段纯合子的纯系，再通过纯系与野生型个体进行配套组合，所生的种蛋入孵第一天通过光学设备照射就可判断种蛋的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种一日龄鉴别鸡受精蛋性别的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n在鸡Z染色体上定点插入标签蛋白基因，并构建基因型为携带标签蛋白基因插入片段纯合子的纯系，再通过纯系与野生型个体进行配套组合，所生的种蛋入孵第一天通过光学设备照射就可判断种蛋的性别。/n

【技术特征摘要】
1.一种一日龄鉴别鸡受精蛋性别的方法，其特征在于，包括以下步骤：
在鸡Z染色体上定点插入标签蛋白基因，并构建基因型为携带标签蛋白基因插入片段纯合子的纯系，再通过纯系与野生型个体进行配套组合，所生的种蛋入孵第一天通过光学设备照射就可判断种蛋的性别。


2.如权利要求1所述的一日龄鉴别鸡受精蛋性别的方法，其特征在于，所述标签蛋白基因为Z染色体上定点位置插入可用于早期鉴别且可被检测到的标记基因。


3.如权利要求2所述的一日龄鉴别鸡受精蛋性别的方法，其特征在于，所述标签蛋白基因为绿色荧光蛋白基因。


4.如权利要求3所述的一日龄鉴别鸡受精蛋性别的方法，其特征在于，构建基因型为携带绿色荧光蛋白基因插入片段纯合子的纯系，具体包括以下的方法步骤：
步骤1：根据禽类Z染色体基因组序列，设计引导RNA序列；
步骤2：通过分子克隆，将引导RNA序列插入到含有xCAS9蛋白的AAV-CRISPR质粒的多克隆位点上，构建CRISPR/CAS基因切割质粒；
步骤3：根据Z染色体上插入位点获取靶序列，再根据靶序列上下游1kb的基因序列分别扩增上游同源臂序列如SEQIDNO:1所示和下游同源臂序列如SEQIDNO:2所示，将上游同源臂序列和下游同源臂序列通过分子克隆与绿色荧光蛋白基因连接，形成供体基因序列，并将供体基因序列克隆到AAV质粒中，构建CRISPR/CAS基因供体质粒；
步骤4：将构建好的CRISPR/CAS基因切割质粒和CRISPR/CAS基因供体质粒分别进行AVV病毒包装，得到两种病毒原液，再分别经纯化、浓缩后得到两种工作液病毒；
步骤5：将得到的两种工作液病毒共同注射到早期的鸡受精卵的胚盘中，并进行孵化；
步骤6：孵化后得到的仔鸡F0代，通过表型和PCR扩增检测进行阳性鉴定；将阳性的F0代鸡与野生型鸡配种，并通过阳性...

【专利技术属性】
技术研发人员：武珅，李东锋，张颖，潘在续，杨秀荣，王建涛，
申请(专利权)人：南京农业大学，首都医科大学附属北京同仁医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32