热稳定性提高的DNA聚合酶突变体及其构建方法和应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种热稳定性提高的DNA聚合酶突变体及其构建方法和应用。本发明专利技术提供的DNA聚合酶突变体包括单点突变体和组合突变体，与野生型DNA聚合酶(AAA32368.1)相比，其单点突变体和组合突变体在65℃下半衰期均更长；尤其是组合突变体，表现出单点突变体热稳定性的叠加效果，其半衰期大约是野生型DNA聚合酶(AAA32368.1)的3倍。基于此，本发明专利技术所提供的DNA聚合酶突变体的热稳定性更好，适于在较高的温度下单分子核序中应用。

DNA polymerase mutant with improved thermal stability and its construction and Application

【技术实现步骤摘要】
热稳定性提高的DNA聚合酶突变体及其构建方法和应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种热稳定性提高的DNA聚合酶突变体及其构建方法和应用。
技术介绍
高通量测序技术(High-throughputsequencing)又称“下一代”测序技术("Next-generation"sequencingtechnology)，以能够一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。单分子测序技术(Single-moleculesequencing)是高通量测序技术的主流发展方向，能够对单个DNA分子进行高通量、长度长的序列读取，并在短时间内获取大量序列信息，因而得到了广泛关注和研究。单分子测序技术的原理分为：边合成边测序方法和直接读取方法，其中，边合成边测序方法的技术成熟度最好、市场接受度最高，该方法利用DNA聚合酶合成与模板互补的DNA链，在核苷酸聚合过程中释放出特异性的荧光信号，从而在三维空间中记录模板位置和核苷酸序列信息，再通过数据处理反向构建DNA模板的序列。DNA聚合酶(DNApolymerase)是边合成边读取单分子测序技术中的核心关键酶，是通过碱基互补配对原理催化底物dNTP(脱氧核苷酸)分子聚合形成子代DNA的一类酶。在单分子测序应用中，DNA聚合酶的稳定性是影响测序性能的关键参数：一方面，单分子测序用的DNA聚合酶蛋白需要完成几千甚至几万个碱基的精确聚合，且每步聚合都伴随着缓冲条件的变化、溶剂的改变、光照变性的影响等等，这需要DNA聚合酶分子在整个测序过程中都保持良好的活性；另一方面，单分子测序用的DNA聚合酶往往需要在测序仪上放置几天甚至几十天或者更久的时间，直到试剂用完，这也对DNA聚合酶试剂的稳定性提出了很高要求；此外，DNA聚合酶试剂在生产销售环节往往需要经历长时间、长距离的运输存储等操作，其稳定性直接影响了产品的货期、保质期等因素，甚至影响着客户对整个测序仪系统的市场认可度等重要商业指标。综上，DNA聚合酶的稳定性是影响整个单分子测序系统性能的重要酶学性质。目前，市场上多种DNA聚合酶都是来源于嗜热微生物，其具有良好的热稳定性，但商品化的耐热DNA聚合酶都无法满足单分子测序要求(具有链置换活性等特殊性质)；而能够满足单分子测序要求的DNA聚合酶大都来源于常温微生物(噬菌体等)，其稳定性较差，难以保证单分子测序过程中良好的热稳定性，并影响其运输及投产使用，从而极大地限制了DNA聚合酶在单分子测序领域中的应用。上述天然的DNA聚合酶的序列、结构和功能都受到自然进化限制，难以直接应用于工业合成生产中，对天然酶的基因进行蛋白质工程手段改造，可以使天然酶打破自然进化对其的限制，从而得到有着工业用途优势的优良的改造后的人工酶基因。
技术实现思路
因此，本专利技术要解决的技术问题在于克服现有的DNA聚合酶热稳定性差的缺陷，从而提供一种热稳定性提高的DNA聚合酶突变体、DNA聚合酶突变体的构建方法及DNA聚合酶突变体在单分子测序中的应用。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种热稳定性提高的DNA聚合酶突变体，所述DNA聚合酶突变体为如下(a1)或(a2)：(a1)将SEQIDNO.2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且与SEQIDNO.2所示的蛋白具有相同功能的衍生蛋白；(a2)通过一个或多个氨基酸残基取代SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的一个或多个位置且与SEQIDNO.2所示的蛋白表现出至少95％同源性的衍生蛋白。优选地，该热稳定性提高的DNA聚合酶突变体，SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的取代位点为第481位、第170位、第318位、第284位、第99位、第499位、第371位、第436位、第243位、第365位、第194位以及第214位。优选地，该热稳定性提高的DNA聚合酶突变体，所述DNA聚合酶突变体包括在SEQIDNO.2所示的氨基酸序列上A481K、I170L、V318A、R284F、M99E、Q499E、E371A、F436I、M243Y、T365Y、G194I、P214N中任一单点突变位点的单点突变体。进一步优选地，该热稳定性提高的DNA聚合酶突变体，所述DNA聚合酶突变体包括在SEQIDNO.2所示的氨基酸序列上V318A/M99E/Q499E/P214N、I170L/V318A/M99E/M243Y/T365Y中任一组合突变位点的组合突变体。本专利技术还提供一种编码如上述热稳定性提高的DNA聚合酶突变体的基因。本专利技术还提供一种包含如上述基因的重组质粒。本专利技术还提供一种包含如上述热稳定性提高的DNA聚合酶突变体的可溶性蛋白、固定化酶或工程菌。本专利技术还提供一种如上述热稳定性提高的DNA聚合酶突变体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：通过在Pfam数据库及NCBI数据库中搜索SEQIDNO.2所示的氨基酸序列，去除重复出现的相同序列，选取与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列一致性大于30％的氨基酸序列，然后通过Clustalx1.83软件进行多序列比对，将剩余氨基酸质序列整理成fasta.文件上传到ConsensusMakerv2.0.0服务器，根据需要修改设置参数后，该在线软件将生成可以后期编辑的consensussequence，筛选出热稳定性相关的突变位点为：A481K、I170L、V318A、R284F、M99E、Q499E、E371A、F436I、M243Y、T365Y、G194I、P214N。本专利技术还提供如上述热稳定性提高的DNA聚合酶突变体在单分子测序中的应用。本专利技术技术方案，具有如下优点：1.本专利技术提供的热稳定性提高的DNA聚合酶突变体，包括单点突变体和组合突变体，与野生型DNA聚合酶(AAA32368.1)相比，其单点突变体和组合突变体在65℃下半衰期均更长；尤其是组合突变体，表现出单点突变体热稳定性的叠加效果，其半衰期大约是野生型DNA聚合酶(AAA32368.1)的3倍。基于此，本专利技术所提供的DNA聚合酶突变体的热稳定性更好，适于在较高的温度下单分子测序。2.本专利技术构建的DNA聚合酶(AAA32368.1)基因工程菌可以高效表达DNA聚合酶突变体，且培养条件简单，培养周期短，表达产物纯化方便等优点。3.本专利技术提供的DNA聚合酶突变体的构建方法，与理性设计基于蛋白质精确结构-功能关系不同的是，本专利技术基于ConsensusConcept理论，通过构建数据库，利用生物信息技术进行检索，筛选和比对同源性序列，从进化的角度分析能提高酶热稳定性的信息，对DNA聚合酶家族序列进行整合分析，并结合生物信息学及晶体学方法辅助，获得具高稳定性的新型DNA聚合酶突变体。4.本专利技术提供的热稳定性提高的DNA聚合酶突变体在应用于单分子测序时具有优良的试剂稳定性和测序准确度，具有较好的应用前景。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种热稳定性提高的DNA聚合酶突变体，其特征在于，所述DNA聚合酶突变体为如下(a1)或(a2)：/n(a1)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且与SEQID NO.2所示的蛋白具有相同功能的衍生蛋白；/n(a2)通过一个或多个氨基酸残基取代SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的一个或多个位置且与SEQ ID NO.2所示的蛋白表现出至少95％同源性的衍生蛋白。/n

【技术特征摘要】
1.一种热稳定性提高的DNA聚合酶突变体，其特征在于，所述DNA聚合酶突变体为如下(a1)或(a2)：
(a1)将SEQIDNO.2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且与SEQIDNO.2所示的蛋白具有相同功能的衍生蛋白；
(a2)通过一个或多个氨基酸残基取代SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的一个或多个位置且与SEQIDNO.2所示的蛋白表现出至少95％同源性的衍生蛋白。


2.根据权利要求1所述的热稳定性提高的DNA聚合酶突变体，其特征在于，SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的取代位点为第481位、第170位、第318位、第284位、第99位、第499位、第371位、第436位、第243位、第365位、第194位以及第214位。


3.根据权利要求1或2所述的热稳定性提高的DNA聚合酶突变体，其特征在于，所述DNA聚合酶突变体包括在SEQIDNO.2所示的氨基酸序列上A481K、I170L、V318A、R284F、M99E、Q499E、E371A、F436I、M243Y、T365Y、G194I、P214N中任一单点突变位点的单点突变体。


4.根据权利要求3所述的热稳定性提高的DNA聚合酶突变体，其特征在于，所述DNA聚合酶突变体包括在SEQIDNO.2所示的氨基酸序列上V318A/M99E/Q499E/P2...

【专利技术属性】
技术研发人员：马富强，周连群，郭振，张艺凡，杨广宇，唐玉国，
申请(专利权)人：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32