用于链霉亲和素偶联微泡分选免疫细胞的注射器制造技术

本申请涉及用于链霉亲和素偶联微泡分选免疫细胞的注射器，其包括：针桶，其上部设置一向外凸起的通气孔；与密封环连接的推杆；与针桶内壁致密组合的密封环，推拉推杆可使密封环在针桶内移动并可吸推液体；设置于针桶下端的针头接口；以可拆卸和连接的方式与针头接口配合使用的针头；用于以密封方式堵塞通气孔和针头接口的堵帽，密封环厚度大于通气孔孔径。该注射器配合本申请记载的方法、试剂，可用于从外周血简易、快速、高效地分离获取免疫细胞、造血干细胞等目标细胞，避免现有磁珠法的磁珠残留、流式分选引入荧光素的弊端等问题，不需要昂贵的仪器设备、成本低、并且对所结合的靶细胞毒性极小、不易使之失活；分选出的细胞纯度、活力高。

Syringe for immunocyte sorting with streptavidin coupled microbubbles

【技术实现步骤摘要】
用于链霉亲和素偶联微泡分选免疫细胞的注射器
本申请涉及用于链霉亲和素偶联微泡分选免疫细胞的注射器。此外，本申请还涉及从血液特别是外周血例如全血中简易、快速、高效地分离获取目标细胞例如免疫细胞、造血干细胞等的方法，还涉及分离出的这些目标细胞在治疗疾病中的应用，具体涉及从健康人体的血液中特别是外周血中简易、快速、高效分离免疫细胞的方法。本申请所述目标细胞例如但不限于CD3+细胞、CD4+细胞、CD8+细胞等T细胞，CD56+细胞等NK细胞，CD19+细胞等B细胞，CD34+细胞等造血干细胞。本申请还特别地涉及细胞分选用链霉亲和素偶联微泡的冻干制剂、其液体制剂、其制备方法和用途。
技术介绍
免疫细胞(immunecell)是人体的一类重要细胞，其也俗称白细胞，包括淋巴细胞和各种吞噬细胞，也特指能识别抗原、产生特异性免疫应答的淋巴细胞。淋巴细胞是免疫系统的基本成分，在体内分布很广泛。研究发现血液中蕴含丰富的淋巴细胞，由于这类细胞具有免疫调控和自我复制等特点，所以一直受到人们的关注。淋巴细胞具有自然杀伤和自我保护的特性，针对病毒、细菌、真菌感染的治疗均起到关键的作用，在癌症的治疗中具有很大的临床应用价值。免疫细胞在健康人体的血液中蕴含丰富，但由于年龄老化、亚健康、罹患疾病等原因，血液中的免疫细胞数目会显著降低，增殖分化能力亦大幅度衰退；而其他健康人的免疫细胞移植给患者则可能引起免疫排斥反应；提取免疫细胞过程对患者的损伤性和在采集时遇到的其他问题，都直接影响了免疫细胞的临床应用，使得寻找一种稳定可靠的免疫细胞获取来源成为一个重要的问题。研究显示，健康人的新鲜血液中含有大量有效的免疫细胞并且能有效分离，这种组织来源的免疫细胞不仅保持了免疫细胞的特异性免疫应答的生物学特性，而且分离出来的免疫细胞具有原始的、强劲的增殖能力，同时还易于冷冻保存和复苏。由于免疫细胞起源于自身，大大减低了触发免疫反应及引起移植物抗宿主病的风险。潜伏性病毒和微生物的感染及传播几率比较低。采集过程简单，对健康的被采集者无任何危害及损伤。以上原因足以令从血液中分离免疫细胞成为获得免疫细胞的有效途径。近些年，随着我们对免疫系统认识不断深入，利用免疫系统的不同组分治疗癌症的免疫疗法的研究取得了重大突破，目前已有一些相关药物通过了美国食品药品管理局的审核并在临床中使用。例如，用抗体治疗乳腺癌、黑色素瘤、淋巴癌、急慢性白血病等；用癌疫苗治疗前列腺癌；用干扰素和IL2等细胞因子增强广泛的免疫应答；多个免疫检查点的抑制剂也已被找到。T细胞作为淋巴细胞的一种，在人体获得性免疫中发挥着至关重要的作用。成熟的T细胞能活化其他免疫细胞，调节免疫功能，识别特异的抗原并杀死受到感染的细胞或者癌细胞。T细胞回输疗法在处理病毒感染病例的实践中由来已久。回输瘤体浸润T细胞疗法在治疗黑色素瘤的临床试验中，证明了T细胞回输针对肿瘤抗原也有一定的疗效。如何利用现有技术快速、高效的从血液中分离出足够用于治疗的T细胞则称为当前肿瘤免疫研究的核心问题和技术难点。目前关于血液免疫细胞的分离方法不一，且大多步骤复杂，获得较多数量血液免疫细胞也存在一定困难，同时患者在罹患疾病时采集血液存在一定风险。因此，本领域需要有从血液中分离免疫细胞的简单、有效的方法，以满足医药、科研、临床应用等领域的需求。细胞分选(cellsorting)是获取较为均一的细胞群体的技术方法。在细胞生物学研究中，获得较为均一的细胞群体(纯化细胞)往往是科研实验及临床研究的必要条件。获取一定纯度的细胞方法主要有两大类技术，一是培养纯化，二是直接分选。培养纯化是较为传统的技术，包括差速贴壁、培养体系筛选等，但周期相对较长，得到的细胞均一性不稳定。细胞分选是快速获取特性细胞的方法，目前应用较多的分选技术包括密度梯度离心、流式细胞分选(FACS)、免疫磁珠(MACS)分选等。免疫磁珠分离技术是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单克隆抗体相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离。免疫磁珠细胞分离技术的细胞回收率及得率取决于磁珠所连接的单抗对细胞的特异性和磁珠的大小(磁性)，然而太小的磁珠得率不高，太大的磁珠又会影响细胞活性，导致后期的检测效果不理想。并且目前市面上多采用微米级甚至纳米级的磁珠，该方法存在诸多局限性：1)磁珠比表面积相对较小，降低了磁珠捕获靶细胞的几率；2)由于磁珠的颗粒性质，其与细胞之间存在多相反应(multiphasereaction)结合，通常需要更久的时间去捕获特异性的靶细胞；3)无论是微米及或是纳米及磁珠，单分散性较差，极易容易产生磁珠的聚集或沉淀从而导致细胞活性降低；4)免疫磁珠的制作过程是将特异性抗体直接偶联到磁珠表面，磁珠本身的性质和其表面带有的疏水或亲水基团容易引起抗体空间构想的改变，从而降低抗体的生物学活性；5)样本粘稠度偏高会导致免疫磁珠的非特异性吸附，从而很难获得纯度较高的靶细胞；6)纳米磁珠直径一般在5nm～1um之间，因其体积较小，极容易因细胞的内吞作用而进入到细胞内部，从而影响了细胞正常的生物学活性且难以去除，给临床免疫治疗带来影响。流式细胞分选技术(FACS)是利用流式细胞仪自带的分选功能，以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，没有充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。虽然流式细胞分选的精度很高，但是依然存在诸多不利因素：1)设备投入资金较大，市场上一台具有分选功能的流式细胞仪一般都在几十万元，这对科研及临床试验的开展无疑造成了不小的经济压力；2)少量细胞分选时，流式细胞分选精确度较高、速度较快。但如果细胞量超过10^9个，则需要耗费10小时以上，并且分选后细胞的活力会受到很大的影响；3)开放性操作较多，因为流式细胞仪的使用局限性，致使其不能安置在洁净区等无菌环境中，若进行流式细胞分选操作势必会在非无菌环境下进行，这对细胞样本质量和后期的培养等都会造成一定影响，甚至染菌。因此流式分选的样本很难用于临床治疗或一些对样本要求严格的科研试验；4)一般流式分选采用的抗体均会标记荧光素，而荧光素难以从分选后的细胞样本中去除，这不但会对后期的实验造成影响，同时更制约着临床治疗的应用。现有技术公开了诸多从外周血分离相关目标细胞的方法，例如CN102876631A(中国专利申请号2012103794314)公开了一种简单有效的血液免疫细胞的提取方法，以及相配套使用的冻存和复苏的方法，以及复苏后免疫细胞扩增的方法，其包括如下步骤：全血样本预处理、Ficoll法分离、MNC收集和洗涤、MNC计数、MNC冻存、细胞复苏、MNC计数和细胞扩增。据信该申请发现使用特定操作步骤的提取、冻存、复苏以及扩增，可以有效地获得免疫细胞，该免疫细胞可用于治疗肿瘤。又例如，CN104694473A(中国专利申请号201510112515.5)公开了一种简单有效的从成人外周血中自动化提取免本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于链霉亲和素偶联微泡分选免疫细胞的注射器，其特征在于包括：/n针桶，该针桶的桶壁上部设置一个向外凸起的通气孔；/n推杆，其与密封环连接；/n密封环，其与针桶内壁致密组合，通过推拉所述推杆能够使得密封环在针桶内上下移动并可吸入或推出液体；/n针头接口，其设置于针桶的下端；/n针头，其以可拆卸和可连接的方式与针头接口配合使用；/n堵帽，其用于以密封方式堵塞通气孔和针头接口，/n其中，所述密封环的厚度大于通气孔的孔径。/n

【技术特征摘要】
1.用于链霉亲和素偶联微泡分选免疫细胞的注射器，其特征在于包括：
针桶，该针桶的桶壁上部设置一个向外凸起的通气孔；
推杆，其与密封环连接；
密封环，其与针桶内壁致密组合，通过推拉所述推杆能够使得密封环在针桶内上下移动并可吸入或推出液体；
针头接口，其设置于针桶的下端；
针头，其以可拆卸和可连接的方式与针头接口配合使用；
堵帽，其用于以密封方式堵塞通气孔和针头接口，
其中，所述密封环的厚度大于通气孔的孔径。


2.根据权利要求1所述用于链霉亲和素偶联微泡分选免疫细胞的注射器，其特征在于，所述密封环的厚度是通气孔孔径的1.5～5倍。


3.根据权利要求1所述用于链霉亲和素偶联微泡分选免疫细胞的注射器，其特征在于，所述密封环的厚度是通气孔孔径的1.5～2.5倍。


4.根据权利要求1所述用于链霉亲和素偶联微泡分选免疫细胞的注射器，其特征在于，所述密封环的厚度是通气孔孔径的...

【专利技术属性】
技术研发人员：许晓椿，肖海蓉，魏卿，牛翰婕，赵梦莲，刘庆喜，
申请(专利权)人：英科博雅基因科技天津有限公司，
类型：新型
国别省市：天津;12