用于纯化硫酸酯酶蛋白的方法技术

本发明专利技术提供一种利用不使用标签(例如His标签等)的金属螯合色谱法纯化硫酸酯酶的方法。实施方案提供一种纯化硫酸酯酶的方法，其包含以下步骤：(a)提供包含一种或多种杂质的含硫酸酯酶的溶液；(b)使用金属亲和色谱树脂对含硫酸酯酶的溶液进行第一色谱分离；(c)使用阳离子交换色谱树脂进行第二色谱分离；(d)使用阴离子交换色谱树脂进行最终色谱分离，其中由此除去杂质。

Method for purification of sulfatase protein

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于纯化硫酸酯酶蛋白的方法
本专利技术涉及一种用于纯化硫酸酯酶蛋白的新方法。
技术介绍
黏多糖贮积症(MPS)是一组由特定溶酶体酶缺陷或缺乏引起的罕见的遗传性溶酶体贮积症。这些酶的缺乏导致复合糖分子在细胞和组织中、以及在称为溶酶体的细胞器中积累。在正常的溶酶体酶的存在下，这些糖被转化为其他物质并被身体使用。这些复合糖被称为黏多糖或糖胺聚糖(GAG)，并充当体内结缔组织的组成部分(buildingblock)。MPSIII是由于缺乏降解GAG所必需的四种不同的酶而导致的。每种酶缺乏定义了圣菲利柏氏综合征(Sanfilipposyndrome)的一种不同形式：IIIA型(圣菲利柏A)、IIIB型(圣菲利柏B)、IIIC型(圣菲利柏C)和IIID型(圣菲利柏D)。乙酰肝素-N-硫酸酯酶(HNS)是一种参与硫酸乙酰肝素的逐步降解的酶。HNS水解连接到硫酸乙酰肝素(一种GAG)的氨基葡萄糖残基的氨基的硫酸酯部分。该酶的缺陷与黏多糖贮积症IIIA(MPS，圣菲利柏氏综合征A)相关。受MPSIIIA型感染的患者具有在HNS编码基因中的突变，导致该酶功能失调、缺陷或缺乏。MPSIIIA(圣菲利柏A)的症状通常在2至6岁之间出现，尽管在某些情况下迟至13岁才被诊断。该病症的临床症状表现为不同的严重程度。在MPSIIIA患者中，中枢神经系统是受影响最严重的系统。HNS和其他次级贮积化合物主要在中枢神经系统中积累。所述病症表征为语言发展、运动技能、和智力发展方面的问题。总体而言，患有MPSIIIA的个体具有明显的发育延迟，并且长期生存不良。该病症使人长期衰弱并危及生命。目前，尚无获批的MPSIIIA治疗方法。已经尝试使用骨髓移植来减缓疾病的进展。由于硫酸乙酰肝素是HNS的天然底物，所以动物研究已表明，HNS可用于治疗其中硫酸乙酰肝素增加的例如MPSIIIA等溶酶体贮积症。固定化金属亲和色谱(IMAC)，也称为金属螯合亲和色谱(MCAC)，是亲和色谱的一个特殊方面。IMAC的原理在于许多过渡金属离子(即锌、铜、镍、和钴等)可以通过氨基酸侧链上的供电子基团与氨基酸组氨酸、半胱氨酸和色氨酸配位的事实。为了将该相互作用用于色谱目的，必须将金属离子固定在不溶性支撑体上。这可以通过将螯合基团连接到色谱基质上来完成。此技术中最常用的螯合基团是亚氨基二乙酸(IDA)。它通过长的亲水性间隔臂与例如SEPHAROSE6B等基质偶联。间隔臂确保螯合金属可被蛋白质上的所有可用的结合位点完全接近。用于IMAC应用的另一个通常采用的螯合基团是三-(羧甲基)-乙二胺(TED)。该特定基团与IDA相比赋予凝胶以不同的特性。相对于IDA凝胶，TED凝胶显示出较强的金属离子保留能力和较弱的蛋白质保留能力。TED凝胶与螯合物(IDA凝胶的多个配位点)形成复合物(单个配位点)。次氮基三乙酸(NTA)是一种四齿配体，其试图平衡金属锚定强度与金属-离子蛋白相互作用特性(Hochuli,E.,H.Dobeli,A.Schacher[1987]J.Chromatography411:177-184)。其他螯合配体已被报告并提及。参见，例如Porath(1992)，见上文。IMAC中最常用的金属是锌和铜；然而，镍钴和钙也已成功使用，并且应在开发步骤中进行测试。通过在实验室进行分离之前准确预测给定蛋白质对IMAC树脂的蛋白质亲和力，可使IMAC在纯化过程中的发展大幅波动。如果可以从IMAC树脂的蛋白质结构中可靠且容易地预测其亲和力，那么在确定开发策略时，将为研究人员提供更好的信息。预测具有高亲和力的蛋白质，例如可以在相对严格的条件下与树脂结合，并通过简单的等度步骤洗脱。相反，对于预测对金属-螯合树脂具有低亲和力的蛋白质，IMAC不应被视为主要纯化步骤。锌-螯合色谱法已被用于人白介素-4(hIL-4)、人白介素-10(hIL-10)和人组织纤维蛋白溶酶原激活物(htPA)的临床生产中。IMAC主要依赖于组氨酸(His)与可逆地结合至固定相的金属离子之间的相互作用。尽管是固定化的，但Zn由于其选择性而被广泛使用，其他金属离子如Cu2+、Ni2+和Co2+也适用于某些蛋白质。已经报告了固定化的金属与蛋白质的色氨酸、酪氨酸或半胱氨酸残基之间的相互作用，然而，它们通常为较弱的相互作用。此外，当组氨酸紧邻芳香族残基或另一个组氨酸时(例如在α螺旋的连续转角(successiveturn)的相同位置上)，观察到导致高亲和力的协同效应。尽管已工程化含有His-Tyr、His-Trp、His-X-X-His的蛋白质前导序列来利用这种现象，但这些序列在自然中相对罕见。因此，对于天然存在的蛋白质，可以得出结论，蛋白质对常规IMAC树脂的亲和力是由His侧链咪唑的可用性决定的。
技术实现思路
专利技术要解决的问题考虑到对HNS作为药剂的兴趣，仍然需要以成本有效的方式制备大量高度纯化的物质。已报告了从培养基中纯化HNS的各种报告(Hemsley等人，Mol.Genet.Metab.90:313-328(2007))。尽管已经尝试并描述了几种纯化HNS的方法，但这些方法包括通过超滤/渗滤(UF/DF)交换缓冲液、然后过滤沉淀的蛋白质(例如用于收获)来使负载pH和电导率适应离子-交换色谱条件的多个步骤。这些步骤通常导致过滤器膜表面的蛋白质损失、以及增加纯化的持续时间与操作和资本支出。先前尚无是否可以利用不使用标签(如His标签等)的金属螯合色谱法来纯化乙酰肝素-N-硫酸酯酶的报告。本专利技术提供了纯化乙酰肝素-N-硫酸酯酶(HNS)的简单且有效的方法，其适合于用于人类治疗的此类蛋白质的有效生产。用于解决问题的方案1.一种纯化硫酸酯酶的方法，其包含以下步骤：(a)提供包含一种或多种杂质的含硫酸酯酶的溶液；(b)使用金属亲和色谱树脂对含硫酸酯酶的溶液进行第一色谱分离；(c)使用阳离子交换色谱树脂进行第二色谱分离；(d)使用阴离子交换色谱树脂进行最终色谱分离，其中由此除去杂质。2.根据所述技术方案1所述的方法，其中使所述金属亲和色谱树脂带有二价金属阳离子。3.根据所述技术方案2所述的方法，其中二价金属是锌。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述阳离子交换色谱树脂选自由强阳离子交换色谱树脂和多模式阳离子交换色谱树脂组成的组。5.根据所述技术方案1所述的方法，其进一步包含以下步骤：使用阳离子交换色谱树脂进行第三色谱分离，其中所述第二色谱分离步骤中使用的树脂为强阳离子交换色谱树脂；并且其中所述第三色谱分离步骤中使用的树脂是多模式阳离子交换色谱树脂。6.根据所述技术方案1所述的方法，其中所述阴离子交换色谱树脂选自由强阴离子交换色谱树脂和弱阴离子交换色谱树脂组成的组。7.根据所述技术方案1所述的方法，其中所述硫酸酯酶在其活性位点具有选自由以下组成的组的金属离子：钙离子、亚铁离子、三价铁离子、和锌离子。8.根据所述技术方案1所述的方法，其中所述硫酸酯酶选自由以下组成的组：乙酰肝素-N-硫酸酯酶、芳本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种纯化硫酸酯酶的方法，其包含以下步骤：/n(a)提供包含一种或多种杂质的含硫酸酯酶的溶液；/n(b)使用金属亲和色谱树脂对含硫酸酯酶的溶液进行第一色谱分离；/n(c)使用阳离子交换色谱树脂进行第二色谱分离；和/n(d)使用阴离子交换色谱树脂进行最终色谱分离，其中由此除去杂质。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种纯化硫酸酯酶的方法，其包含以下步骤：
(a)提供包含一种或多种杂质的含硫酸酯酶的溶液；
(b)使用金属亲和色谱树脂对含硫酸酯酶的溶液进行第一色谱分离；
(c)使用阳离子交换色谱树脂进行第二色谱分离；和
(d)使用阴离子交换色谱树脂进行最终色谱分离，其中由此除去杂质。


2.根据权利要求1所述的方法，其中使所述金属亲和色谱树脂带有二价金属阳离子。


3.根据权利要求2所述的方法，其中所述二价金属是锌。


4.根据权利要求1所述的方法，其中所述阳离子交换色谱树脂选自由强阳离子交换色谱树脂和多模式阳离子交换色谱树脂组成的组。


5.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括使用阳离子交换色谱树脂进行第三色谱分离的步骤，
其中所述第二色谱分离步骤中使用的树脂是强阳离子交换色谱树脂；和
其中所述第三色谱分离步骤中使用的树脂是多模式阳离子交换色谱树脂。


6.根据权利要求1所述的方法，其中所述阴离子交换色谱树脂选自由强阴离子交换色谱树脂和弱阴离子交换色谱树脂组成的组。


7.根据权利要求1所述的方法，其中所述硫酸酯酶在其活性位点具有选自由以下组成的组的金属离子：钙离子、亚铁离子、三价铁离子和锌离子。


8.根据权利要求1所述的方法，其中所述硫酸酯酶选自由以下组成的组：乙酰肝素-N-硫...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·费辛，朴炳铉，辛庸源，
申请(专利权)人：株式会社绿十字，
类型：发明
国别省市：韩国;KR