采用饥饿发酵工艺生产基因治疗质粒的方法及发酵培养基技术

本发明专利技术公开一种采用饥饿发酵工艺生产基因治疗质粒的方法，包括以下步骤：(1)发酵罐准备：将一次性pH电极、一次性DO电极和冷却管路插入一次性罐体相应位置；发酵培养基配制好后将一次性罐体灭菌；完成发酵罐各管路的连接，设定温控系统(TCU)的温度并运行；(2)参数设置；(3)接种；(4)饥饿发酵控制。本发明专利技术的方法结合了饥饿发酵工艺和一次性全封闭式工艺，能够显著降低质粒产品中细菌宿主蛋白HCP残留含量。本发明专利技术还公开一种用于前述方法的发酵培养基，能够有效提高质粒发酵产量。

The method and culture medium of producing gene therapy plasmid by starvation fermentation

【技术实现步骤摘要】
采用饥饿发酵工艺生产基因治疗质粒的方法及发酵培养基
本专利技术属于生物
中用于基因治疗质粒的发酵方法，特别是涉及一种采用饥饿发酵工艺生产基因治疗质粒的方法及一种安全且高产的发酵培养基。
技术介绍
基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。基因治疗已成为很多重大疾病的有效治疗方法，在血友病、镰状细胞病、失明、多种严重的遗传性神经退行性疾病以及骨髓和淋巴结多发癌等疾病的治疗中均取得了重大进展(Genetherapycomesofage,2018,Science)。目前欧洲药品管理局(EMA)和美国食品药品管理局(FDA)已经批准6种基因治疗产品：2种用于B细胞癌的嵌合抗原受体T细胞产品(Car-T)和4种用于严重单基因疾病，如β-地中海贫血，一种罕见的视力丧失，脊髓性肌萎缩和罕见的原发性免疫缺陷(Genetherapy,2019,TheNewEnglandJournalofMedicine)。基因治疗主要采用病毒和非病毒两种载体形式。从长远看，非病毒载体具有低免疫原型、低成本、易规模化等优点，因而具有更好的临床应用前景。而当前大部分细胞和基因治疗项目所采用的载体都为病毒载体。目前最为常用的病毒载体包括腺相关病毒(Adeno-associatedvirus，AAV)、慢病毒(Lentivirus，LV)、腺病毒(Adenovirus，AdV)和逆转录病毒(Retrovirus，RV)等。这些病毒载体均可以通过包装质粒进行生产，因此，无论是从眼前看，还是从长远看，质粒DNA都是基因治疗的基础，而且需求量非常大。质粒作为人用生物制品，对其生产与质量控制具有严格的要求。虽然已有专利(CN1914330B，2012；CN101213294B，2013)建立大规模符合药学规格的质粒DNA发酵工艺，但均为传统发酵方法，未涉及一次性全封闭式生产工艺。一次性全封闭式生产工艺是基因治疗行业的发展趋势，工艺更加稳定可控，产品质量更加安全有效。众所周知，通过细菌发酵及碱裂解法(ArapidalkalineextractionprocedureforscreeningrecombinantplasmidDNA,1979,NucleicAcidsRes)可获得质粒。但目前的专利中(CN1914330B，2012；CN101213294B，2013；CN103396975B，2016；CN108148831A，2018；CN109337834A，2019)均未涉及饥饿发酵法生产质粒。以上发酵方法中存在质粒产品中HCP残留高的缺点且未考察如何降低HCP残留，例如专利CN108148831A(2018)中宿主蛋白HCP残留为0.001μg/μg质粒DNA，折合为1000ng/mg，质粒产品中HCP残留高。现有文献中(IndustrialManufacturingofPlasmid-DNAProductsforGeneVaccinationandTherapy，2012)报道用于DNA疫苗的宿主蛋白残留量控制为＜1％，折后为10μg/mg，因此，生产的基因治疗质粒产品中HCP残留量应当符合该DNA疫苗的要求。现有文献中没有给出如何通过上游发酵工艺克服质粒产品的质量问题(如HCP残留)的指导。专利CN103396975B(2016)中公布了一种DNA疫苗的发酵培养基配方，每1L发酵培养基含：眎蛋白胨16.5g，酵母粉5g，NaCl10g，甘油0.65g，Na2HPO412.8g，K2HPO43g，MgSO40.24g，NH4Cl3.1g及微量元素1mL。该配方中含有微量金属元素，工艺中引入了重金属杂质，使用于人体注射的DNA疫苗具有一定的安全风险。该专利采用该发酵培养基，质粒发酵(5L)产量达180mg/L～220mg/L，产量较低。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于，提供一种生产基因治疗质粒的方法，能够显著降低质粒产品中细菌宿主蛋白HCP残留含量。为解决上述技术问题，本专利技术提供的技术方案为：一种采用饥饿发酵工艺生产基因治疗质粒的方法，包括以下步骤：(1)发酵罐准备：将一次性pH电极、一次性DO电极和一次性冷却管路插入一次性罐体相应位置；发酵培养基配制好后将一次性罐体灭菌；完成发酵罐各管路的连接，设定温控系统(TCU)的温度并运行；(2)参数设置：设置工艺空气减压阀压力0.50bar；设置发酵罐参数：温度37.0℃、通气量3.0L/min、转速200rpm；设置pH7.20±0.02开启自动控制补碱瓶进行补碱；在移除溶氧电极线时调节DO零点0％，插上电极线，设置最大转速，调节DO满度95-100％；(3)接种：通过接种管路接种，即通过无菌接管机将摇瓶的一次性转接盖管路与发酵罐连接，将摇瓶中菌液泵入发酵罐，用并无菌封管机封闭管路；(4)饥饿发酵控制：将DO与转速关联控制，控制DO≥20％，设置最小转速为初始转速，开启DO自动控制；定义接种时间为0小时，当培养至DO值开始升高时，开始补料，设定补料泵速度0.5％-2％发酵体积/h；当DO值再次开始升高时，提高补料泵速度至1％-4％发酵体积/h；当培养至平台期时停止补料；待DO上升至40％以上后，继续饥饿发酵培养20min～2h之后结束发酵。具体的，所述步骤(1)中，发酵罐各管路的连接包括补料管路、补碱管路、接种管路、发酵罐进气管路、发酵罐排气管路、冷却管路的连接。各管路连接时，使用无菌接管机及无菌封管机进行连接操作。其中，补料管路通过补料泵接入发酵罐；补碱管路通过补碱泵接入发酵罐；接种管路通过无菌接管机将摇瓶的一次性转接盖管路与发酵罐连接，通过蠕动泵将摇瓶中菌液泵入发酵罐，用并无菌封管机封闭管路；发酵罐进气管路通过发酵控制器与车间供气管路连接；发酵罐排气管路通过蒸汽冷却装置与0.22μm滤器排出；冷却管路通过温度控制器与一次性冷却管路连接。具体的，所述步骤(1)中，一次性pH电极使用之前先进行电极校准。具体的，所述步骤(1)中，所述灭菌的条件为121.0℃，20min灭菌。灭菌在脉动真空灭菌器中进行。具体的，所述步骤(1)中，温控系统(TCU)的温度设定为4-10℃。具体的，所述步骤(1)中，发酵培养基的配方为：每1L发酵培养基含：大豆蛋白胨10g-20g，酵母粉5g～10g，(NH4)2SO42g～6g，Na2HPO4·7H2O12g～24g，KH2PO42g～4g，甘油15g～30g，MgSO40.4g～0.8g。所述发酵培养基的配方中还含有适量的消泡剂，约0.3～1g。优选的，所述发酵培养基的配方为：每1L发酵培养基含：大豆蛋白胨20g，酵母粉10g，(NH4)2SO44g，Na2HPO4·7H2O17.8g，KH2PO43g，甘油25g，MgSO40.6g。优选的，所述步骤(4)中，初始补料速率为1.2％-1.5％发酵体积/h，然后补料速率提高至2.4％-3.0％发酵体积/h。优选的，所述步骤(4)中，当发酵培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种采用饥饿发酵工艺生产基因治疗质粒的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)发酵罐准备：将一次性pH电极、一次性DO电极和一次性冷却管路插入到一次性罐体相应位置；发酵培养基配制好后将一次性罐体灭菌；完成发酵罐各管路的连接，设定温控系统(TCU)的温度并运行；/n(2)参数设置：设置工艺空气减压阀压力0.50bar；设置发酵罐参数：温度37.0℃、通气量3.0L/min、转速200rpm；设置pH7.20±0.02开启自动控制补碱瓶进行补碱；在移除溶氧电极线时调节DO零点0％，插上电极线，设置最大转速，调节DO满度95-100％；/n(3)接种：通过接种管路接种，即通过无菌接管机将摇瓶的一次性转接盖管路与发酵罐连接，将摇瓶中菌液泵入发酵罐，用并无菌封管机封闭管路；/n(4)饥饿发酵控制：将溶氧DO与转速关联控制，控制DO≥20％，设置最小转速为初始转速，开启DO自动控制；定义接种时间为0小时，当培养至DO值开始升高时，开始补料，设定补料泵速度0.5％-2％发酵体积/h；当DO值再次开始升高时，提高补料泵速度至1％-4％发酵体积/h；当培养至平台期时停止补料；待DO上升至40％以上后，继续饥饿发酵培养20min～2h之后结束发酵。/n...

【技术特征摘要】
1.一种采用饥饿发酵工艺生产基因治疗质粒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)发酵罐准备：将一次性pH电极、一次性DO电极和一次性冷却管路插入到一次性罐体相应位置；发酵培养基配制好后将一次性罐体灭菌；完成发酵罐各管路的连接，设定温控系统(TCU)的温度并运行；
(2)参数设置：设置工艺空气减压阀压力0.50bar；设置发酵罐参数：温度37.0℃、通气量3.0L/min、转速200rpm；设置pH7.20±0.02开启自动控制补碱瓶进行补碱；在移除溶氧电极线时调节DO零点0％，插上电极线，设置最大转速，调节DO满度95-100％；
(3)接种：通过接种管路接种，即通过无菌接管机将摇瓶的一次性转接盖管路与发酵罐连接，将摇瓶中菌液泵入发酵罐，用并无菌封管机封闭管路；
(4)饥饿发酵控制：将溶氧DO与转速关联控制，控制DO≥20％，设置最小转速为初始转速，开启DO自动控制；定义接种时间为0小时，当培养至DO值开始升高时，开始补料，设定补料泵速度0.5％-2％发酵体积/h；当DO值再次开始升高时，提高补料泵速度至1％-4％发酵体积/h；当培养至平台期时停止补料；待DO上升至40％以上后，继续饥饿发酵培养20min～2h之后结束发酵。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，发酵罐各管路的连接包括补料管路、补碱管路、接种管路、发酵罐进气管路、发酵罐排气管路、冷却管路的连接。


3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，各管路连接时，使用无菌接管机及无菌封管机进行连接操作。


4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，一次性pH电极使用之前先进行电极校准。


5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述灭菌的条件为121.0℃，20min灭菌。


6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，温控系统的...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾杰，梁焯，曹曦，姚树元，辛晨浩，
申请(专利权)人：无锡生基医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32