本发明专利技术公开了一种检测血液中HBV pgRNA的试剂盒，属于分子生物学技术领域，试剂盒包括扩增试剂，扩增试剂包括PCR反应液Ⅰ，PCR反应液Ⅰ包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物以及SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的探针。本发明专利技术提供的试剂盒，利用RNA单链需逆转录的特点，在逆转录引物的5’端增加一段特异的非HBV的序列，同时将合成该段序列的寡核苷酸作为cDNA扩增的引物，达到特异性扩增pgRNA的目的，检测过程中不受DNA干扰，有效提高了试剂盒检测时的灵敏度，对乙肝病毒pgRNA的检测下限可达10copies/ml。
A kit for detecting HBV pgRNA in blood
【技术实现步骤摘要】
一种检测血液中HBVpgRNA的试剂盒
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种检测血液中HBVpgRNA的试剂盒。
技术介绍
乙型肝炎病毒(HBV)感染是引起肝脏疾病，如肝硬化和原发性肝癌，最常见的病因之一。全球超过20亿人感染了乙肝病毒，约有2.4亿慢性乙型肝炎患者，我国约有9300万慢性乙肝病毒携带者，其中发展为慢性乙型肝炎的患者约2000～3000万人。乙型肝炎病毒属于嗜肝性DNA病毒，病毒侵入人体后，通过preS1区域与肝细胞膜上钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白受体结合，脱去包膜后进入肝细胞质，释放松环DNA(rcDNA)进入肝细胞核，在肝细胞核中rcDNA转变成共价闭合环状DNA(cccDNA)，再以cccDNA为模板转录出4种mRNA，其中长度3.5Kb的前基因组RNA(pgRNA)包含HBVDNA上的所有遗传信息，并且pgRNA能够在胞质中逆转录形成rcDNA和病毒蛋白，最后装配成完整的HBV，释放至肝细胞外，而一部分rcDNA进入细胞核中，再转变成cccDNA，形成乙肝病毒持续复制的过程。cccDNA能以游离的形态长期稳定存在于肝细胞核中，所以cccDNA的水平与乙肝复发有极大的相关性，而cccDNA的检测需要对患者肝脏进行穿刺取样，侵入性检查会对患者造成一定伤害。有研究表明慢性乙肝患者血清中存在pgRNA，pgRNA来源于非整合的完整的HBV基因组，以衣壳化HBVpgRNA病毒颗粒形式进入血液中，pgRNA能够反映肝脏内cccDNA的转录活动状态，在HBeAg阳性HBV感染者中，血清pgRNA与肝内cccDNA的水平呈正相关，所以pgRNA可以作为HBV病毒复制和预后的敏感性血清标志物，HBVpgRNA持续阴性和低HBsAg水平可以判定为慢性乙型肝炎的“准临床治愈”，在指导乙肝治疗安全停药方面具有重要意义。但目前市场上用于检测pgRNA的技术和试剂盒较少，且pgRNA的检测易受到来自DNA的干扰，已有产品的灵敏度不能满足实际需求。虽然申请号为201611099305.8的中国专利技术专利，公开了一种组合物、其应用以及含有该组合物的试剂盒，其能够对血液中的HBVpgRNA定量检测，且灵敏度可低至5个拷贝，但是其检测是基于数字PCR技术，而基于荧光定量PCR检测技术的试剂盒还无法达到上述灵敏度。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是：提供一种利用荧光定量PCR检测技术的高灵敏度HBVpgRNA检测试剂盒。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：一种检测血液中HBVpgRNA的试剂盒，包括扩增试剂，所述扩增试剂包括PCR反应液Ⅰ，所述PCR反应液Ⅰ包括SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示的引物以及SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示的探针(见表1)。表1本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供的试剂盒，利用RNA单链需逆转录的特点，在逆转录引物的5’端增加一段特异的非HBV的序列，同时将合成该段序列的寡核苷酸作为cDNA扩增的引物，达到特异性扩增pgRNA的目的，使得检测过程中不受DNA干扰，有效提高了试剂盒检测时的灵敏度，对乙肝病毒pgRNA的检测下限(最低检出限)可达10copies/ml。附图说明图1所示为本专利技术具体实施方式的检测血液中HBVpgRNA的试剂盒的灵敏度检测结果图；图2所示为本专利技术具体实施方式的检测血液中HBVpgRNA的试剂盒的特异性检测结果图。具体实施方式为详细说明本专利技术的
技术实现思路
、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。本专利技术最关键的构思在于：在逆转录引物的5’端增加一段特异的非HBV的序列，同时将合成该段序列的寡核苷酸作为cDNA扩增的引物。请参照图1至图2所示，本专利技术的一种检测血液中HBVpgRNA的试剂盒，包括扩增试剂，所述扩增试剂包括PCR反应液Ⅰ，所述PCR反应液Ⅰ包括SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示的引物以及SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示的探针。从上述描述可知，本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供的试剂盒，利用RNA单链需逆转录的特点，在逆转录引物的5’端增加一段特异的非HBV的序列，同时将合成该段序列的寡核苷酸作为cDNA扩增的引物，达到特异性扩增pgRNA的目的，使得检测过程中不受DNA干扰，有效提高了试剂盒检测时的灵敏度，对乙肝病毒pgRNA的检测下限(最低检出限)可达10copies/ml。进一步的，所述PCR反应液Ⅰ还包括PCR缓冲液、dATP、dUTP、dGTP和dCTP。进一步的，所述扩增试剂还包括内标，所述内标为克隆质粒。进一步的，所述括扩增试剂还包括PCR反应液Ⅱ，所述PCR反应液Ⅱ包括Taq酶、UDG酶、MMLV逆转录酶和RNase抑制剂。进一步的，所述括扩增试剂还包括阳性质控品、阴性质控品和定量参考品，所述阳性质控品为HBV阳性血清样本，所述阴性质控品为HBV阴性血清样本，所述定量参考品为定值的HBV阳性血清样本。进一步的，上述的试剂盒还包括pgRNA提取试剂，所述pgRNA提取试剂包括裂解液、抑制物去除液、洗涤液A、洗涤液B、洗脱液和DNA消化反应液。从上述描述可知，通过设置pgRNA提取试剂，便于利用同一试剂盒快速进行血液中HBVpgRNA的检测。进一步的，所述裂解液为硫氰酸胍，所述抑制物去除液为蛋白酶K，所述洗涤液A由硫氰酸胍和无水乙醇组成，所述洗涤液B由氯化钠和无水乙醇组成，所述洗脱液为灭菌纯化水，所述DNA消化反应液为DNaseⅠ。实施例1：一种检测血液中HBVpgRNA的试剂盒，包括表2所示组分，其中引物和探针的序列如SEQIDNO:1-SEQIDNO:5所示；表2其中，PCR反应液1中dATP、dUTP、dGTP、dCTP为0.5-2mM、Mg2+为2-4mM、引物为200-500nM、探针为100-300nM。所述内标中克隆质粒的基因序列为：taggaggctgtaggcataaagttcgtagtggtgtcacacgtctgtctcgcacgctagctcctcaggtgtcgtagtgtggacacatacgggctaaacag。所述定量参考品1、定量参考品2、定量参考品3、定量参考品4分别为1×104copies/ml、1×105copies/ml、1×106copies/ml、1×107copies/ml的阳性血清样本。所述阳性质控品1和阳性质控品2分别为1×103-5×104copies/ml和1×106-5×107copies/ml的阳性血清样本。实施例2：利用实施例1的试剂盒，检测血液中HBVpgRNA，具体步骤如下：1、病毒核酸提取1)配制相关试剂。2)取2.0ml离心管n个并编号(n＝样本例数+阳性质控本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测血液中HBV pgRNA的试剂盒，其特征在于，包括扩增试剂，所述扩增试剂包括PCR反应液Ⅰ，所述PCR反应液Ⅰ包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物以及SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的探针。/n
【技术特征摘要】
1.一种检测血液中HBVpgRNA的试剂盒，其特征在于，包括扩增试剂，所述扩增试剂包括PCR反应液Ⅰ，所述PCR反应液Ⅰ包括SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示的引物以及SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示的探针。
2.根据权利要求1所述的检测血液中HBVpgRNA的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液Ⅰ还包括PCR缓冲液、dATP、dUTP、dGTP和dCTP。
3.根据权利要求1所述的检测血液中HBVpgRNA的试剂盒，其特征在于，所述扩增试剂还包括内标，所述内标为克隆质粒。
4.根据权利要求1所述的检测血液中HBVpgRNA的试剂盒，其特征在于，所述括扩增试剂还包括PCR反应液Ⅱ，所述PCR反应液Ⅱ包括Taq酶、UDG酶、MMLV逆转录酶和RNase抑制...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭文浒，袁青，林碧宇，薛怡婷，
申请(专利权)人：阿吉安福州基因医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35
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