阿司匹林基因多态性多重荧光探针溶解曲线PCR法检测试剂制造技术

本发明专利技术涉及体外核酸检测技术领域，具体而言，采用了不对称PCR技术结合荧光探针溶解曲线技术用于检测与阿司匹林个体化用药6个相关基因多态位点的特异性引物、荧光探针组成的试剂。本发明专利技术提供的用于检测与阿司匹林个体化用药6个相关基因多态性位点的特异性引物和荧光探针组试剂，6个相关基因为GPIIIa PlA1/A2、PEAR1、PTGS1、GP1BA、GSTP1和LTC4S基因多态性。该试剂灵敏度高，可准确检出低至0.1ng/μL基因组DNA；特异性好，高达300ng/μL基因组DNA不会产生非特异性扩增；整个荧光PCR检测过程只需要90分钟即可完成，检测结果直观易判读。

Detection reagent of aspirin gene polymorphism by multiplex fluorescence probe dissolution curve PCR

【技术实现步骤摘要】
阿司匹林基因多态性多重荧光探针溶解曲线PCR法检测试剂
本专利技术涉及体外核酸检测
，具体涉及一种阿司匹林基因多态性多重荧光探针溶解曲线PCR法检测试剂。
技术介绍
阿司匹林在临床中的应用非常广泛，是常用的非甾体抗炎药，而小剂量阿司匹林可以抑制血小板和动脉血栓的形成，发挥抗凝作用。研究证实，阿司匹林的抗凝疗效存在较大的个体差异，接受冠状动脉搭桥手术的患者、心肌梗死幸存者甚至健康的年轻志愿者中都存在阿司匹林抵抗的现象，30％-40％的脑卒中或外周血管疾病患者存在阿司匹林抵抗，并且与非阿司匹林抵抗患者相比，这些患者在2年内再次发生心血管事件的风险高达80％。目前，尚不能完全解释造成这种个体差异的原因，但基因多态性是其中一个非常重要的影响因素。糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体复合物(GPⅢ)的遗传多态性(PlA1/PlA2)是阿司匹林抵抗的重要因子，GPⅢ受体为血小板聚集最终通路上的关键受体，故GPⅢ受体的任何变化均会引起包括阿司匹林在内的各类抗血小板药物反应性的变化。目前已发现多个GPⅢ受体多态性位点，较为常见的是rs5918(Leu33Pro)，编码Leu的位点称为PlA1，编码Pro的位点称为PlA2。研究表明，携带有PlA2等位基因的患者血小板的生成能力增强同时活化，颗粒释放和纤维蛋白原结合的阈值降低，需要服用更大剂量的阿司匹林才能够有效发挥抗凝作用。并且，PlA2/PlA2基因型携带者比PlA1/PlA1和PlA1/PlA2患者发生缺血性心脏病的风险高4倍。血小板内皮聚集受体-1(PEAR1)的基因多态性rs12041331与患者的抗血小板治疗反应性密切相关。其中，与GG纯合子相比，无论是单用阿司匹林还是阿司匹林联合氯吡格雷双抗治疗，A等位基因携带者的心血管事件风险及死亡率均明显升高。荨麻疹是服用阿司匹林常见的不良反应，研究证实，白三烯C4合成酶(LTC4S)基因多态性rs730012(-444A＞C)可以作为阿司匹林诱发荨麻疹的生物标记物，C等位基因携带者服用阿司匹林发生超敏反应的患者显著高于A等位基因携带者。阿司匹林联合用药个体化治疗：(一)如基因未发生突变，可按正常剂量使用。(二)如发生突变尤其为突变纯合型1、GPIIIaPlA2(T>C)CC基因型，行支架术后，其亚急性血栓事件发生率是TT型的5倍，需要增加阿司匹林剂量才能达到抗凝效果。(但由于高剂量阿司匹林会增加出血风险，一旦出血，可能会被认为是用药不当，故首选建议换用标准剂量的双嘧达莫。若抗血小板强度不足，可加用西洛他唑，行双抗治疗。)应联合使用增强胃黏膜屏障功能的药物，如米索前列醇等或使用H2受体阻断剂如法莫替丁或PPI类药物(首选PPI类药物)。建议同时关注血小板凝集等数据。2、PEAR1(G>A)：GG等位基因对阿司匹林抗血小板应答好；GA型可使用但应密切关注血小板等检测，如抵抗，及时调整方案。AA基因型，用阿司匹林心梗和死亡率高可换用双嘧达莫。如仍不能达到抗凝效果可加用西洛他唑进行双联治疗。3、PTGS1(-842A>G)：PTGS1：GG基因型，阿司匹林抵抗风险高(HR：10)，心血管事件发生率高(HR：2.55)。AG基因型风险中等应密切关注阿司匹林治疗效果；AA基因型阿司匹林较敏感，心血光事件发生率较低。如发生突变建议同上。4、GP1BA：CC基因型，阿司匹林抵抗风增加；CT和TT型，抵抗风险降低。发生突变用药建议同上5、GSTP1：GG和AG型，使用阿司匹林，消化道出血风险，是AA型的2.08倍如发生基因突变应在长期使用阿司匹林时应同时服用PPI类药物，以预防消化系统出血。6、LTC4S：AA基因型，使用阿司匹林发生荨麻疹的风险较AC,CC型低。突变患者应注意药源性皮疹的发生。目前针对基因多态性检测的技术有很多，最常用的有聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析、序列特异性PCR、一代测序、二代测序等技术，但是这些技术有各自的应用缺陷，有的操作繁琐，检测周期长，无法进行高通量多位点同时检测，使得目前在临床上对于多态性检测技术应用仍不理想，一直无法满足临床检测需求。多重荧光探针PCR结合高分辨熔解曲线法是一种新型的单核苷酸的多态性(SingleNucleotidePolymorphisms，SNP)分析技术，是在高分辨溶解曲线技术的基础上进行了改良，将高分辨溶解曲线中的饱和染料用多重荧光探针来替代，而探针设计的位置就在SNP位点上，使检测结果更直接，更加特异，并且最大的优势是可以进行分型检测，一条探针区分一个SNP位点的所有多态性情况，结合多色荧光检测，使检测通量大大提升，而传统荧光探针PCR法一个荧光通道只能检测一种基因型，如果采用多重荧光探针熔解曲线法一个通道可以检测3个基因的9个基因型甚至可以更多，使通量放大n倍，更需要说明的是采用常规荧光PCR方法面临亚型间的干扰，从而判读多数采用Ct值差的方法，使检测结果变得不稳定。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供阿司匹林个体化用药指导基因检测的试剂及其应用，包括分别检测GPIIIaPlA1/A2、PEAR1、PTGS1、GP1BA、GSTP1和LTC4S等6个基因多态性的试剂。本专利技术提供一种阿司匹林基因多态性多重荧光探针溶解曲线PCR法检测试剂，包括6组引物对或6条荧光探针的至少一组引物对或探针：GPIIIaPlA1/A2基因引物对、探针如下：上游引物：5’-AAGTGGTAGGGCCTGCAGGAGGTAGAG-3’；下游引物：5’-CCTTCAGCAGATTCTCCTTCAG-3’；荧光探针：FAM-GCCCTGCCTCCGGGCTCAC-BHQ1；PEAR1基因引物对、荧光探针如下：上游引物：5-CAGAGAAGCTGGAAGGGAGCCCGTG-3’下游引物：5–GAGTTCCTGGTGGACAAGAGGATCC-3’荧光探针：HEX-TCTCACTTCCGTCACCCTTAC-BHQ1；PTGS1基因引物对、荧光探针如下：上游引物：5-CCAGCCCTGGAATCTGAGTTCAGAGATC-3’下游引物：5-ATCCCAGAGGGTGGTTGTAAGATT-3’荧光探针：Cy5-ACTACATGCTGGACACTGCACC-BHQ1；GP1BA基因引物对、荧光探针如下：上游引物：5–GCGTGGTCTTGGCGAACTCCAAGAG-3’下游引物：5-AGCTCAGTCAAGTTGTTGTTAG-3’荧光探针：FAM-AGGGCTCCTGACGCCCACA-BHQ1；GSTP1基因引物对、荧光探针如下：上游引物：5-GGCAGCCCTGGTGGACATGGTGAATG-3’下游引物：5-GCACAAGAAGCCCCTTTCTTTGTTC-3’荧光探针：HEX-CTGCAAATACATCTCCCTCAT-BHQ1；LT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种阿司匹林基因多态性多重荧光探针溶解曲线PCR法检测试剂的引物组、荧光探针，其特征在于，包括6组引物对或6组荧光探针的至少一组引物对或探针：/nGPIIIaPlA1/A2基因引物对、探针如下：/n上游引物：5’-AAGTGGTAGGGCCTGCAGGAGGTAGAG-3’；/n下游引物：5’-CCTTCAGCAGATTCTCCTTCAG-3’；/n荧光探针：FAM-GCCCTGCCTCCGGGCTCAC-BHQ1；/nPEAR1基因引物对、荧光探针如下：/n上游引物：5-CAGAGAAGCTGGAAGGGAGCCCGTG-3’/n下游引物：5–GAGTTCCTGGTGGACAAGAGGATCC-3’/n荧光探针：HEX-TCTCACTTCCGTCACCCTTAC-BHQ1；/nPTGS1基因引物对、荧光探针如下：/n上游引物：5-CCAGCCCTGGAATCTGAGTTCAGAGATC-3’/n下游引物：5-ATCCCAGAGGGTGGTTGTAAGATT-3’/n荧光探针：Cy5-ACTACATGCTGGACACTGCACC-BHQ1；/nGP1BA基因引物对、荧光探针如下：/n上游引物：5–GCGTGGTCTTGGCGAACTCCAAGAG-3’/n下游引物：5-AGCTCAGTCAAGTTGTTGTTAG-3’/n荧光探针：FAM-AGGGCTCCTGACGCCCACA-BHQ1；/nGSTP1基因引物对、荧光探针如下：/n上游引物：5-GGCAGCCCTGGTGGACATGGTGAATG-3’/n下游引物：5-GCACAAGAAGCCCCTTTCTTTGTTC-3’/n荧光探针：HEX-CTGCAAATACATCTCCCTCAT-BHQ1；/nLTC4S基因引物对、荧光探针如下：/n上游引物：5-AGGGTTTGGCAGGGGTTGCCAG-3’/n下游引物：5-ACATCATGCTGGAGCCAGCCCCAG-3’/n荧光探针：CY5-TGGGGACAGGGAACAGAT-BHQ1。/n...

【技术特征摘要】
1.一种阿司匹林基因多态性多重荧光探针溶解曲线PCR法检测试剂的引物组、荧光探针，其特征在于，包括6组引物对或6组荧光探针的至少一组引物对或探针：
GPIIIaPlA1/A2基因引物对、探针如下：
上游引物：5’-AAGTGGTAGGGCCTGCAGGAGGTAGAG-3’；
下游引物：5’-CCTTCAGCAGATTCTCCTTCAG-3’；
荧光探针：FAM-GCCCTGCCTCCGGGCTCAC-BHQ1；
PEAR1基因引物对、荧光探针如下：
上游引物：5-CAGAGAAGCTGGAAGGGAGCCCGTG-3’
下游引物：5–GAGTTCCTGGTGGACAAGAGGATCC-3’
荧光探针：HEX-TCTCACTTCCGTCACCCTTAC-BHQ1；
PTGS1基因引物对、荧光探针如下：
上游引物：5-CCAGCCCTGGAATCTGAGTTCAGAGATC-3’
下游引物：5-ATCCCAGAGGGTGGTTGTAAGATT-3’
荧光探针：Cy5-ACTACATGCTGGACACTGCACC-BHQ1；
GP1BA基因引物对、荧光探针如下：
上游引物：5–GCGTGGTCTTGGCGAACTCCAAGAG-3’
下游引物：5-AGCTCAGTCAAGTTGTTGTTAG-3’
荧光探针：FAM-AGGGCTCCTGACGCCCACA-BHQ1；
GSTP1基因引物对、荧光探针如下：
上游引物：5-GGCAGCCCTGGTGGACATGGTGAATG-3’
下游引物：5-GCACAAGAAGCCCCTTTCTTTGTTC-3’
荧光探针：HEX-CTGCAAATACATCTCCCTCAT-BHQ1；
LTC4S基因引物对、荧光探针如下：
上游引物：5-AGGGTTTGGCAGGGGTTGCCAG-3’
下游引物：5-ACATCATGCTGGAGCCAGCCCCAG-3’
荧光探针：CY5-TGGGGACAGGGAACAGAT-BHQ1。


2.根据权利要求1所述的引物组、荧光探针，其特征在于，所述引物组包括6组引物对和6条荧光探针。


3.一种阿司匹林基因多态性多重荧光探针溶解曲线PCR法检测试剂，其特征在于，所述试剂包括权利要求1或2所述引物组、荧光探针和6个基因多态性质粒阳性标准品，所述标准品序列如下：
GPIIIaPlA1/A2标准品序列：
GPIIIaPlA1/A2突变型：
5’-CAGGAAAGACCACAACAATTTGTTTATGCTCCAATGTACGGGGTAAACTCTTAGCTATTGGGAAGTGGTAGGGCCTGCAGGAGGTAGAGAGTCGCCATAGCTCTGATTGCTGGACTTCTCTTTGGGCTCCTGTCTTACAGGCCCTGCCTCTGGGCTCACCTCGCTGTGACCTGAAGGAGAATCTGCTGAAGGATAACTGTGCCCCAGAATCCATCGAGTTCCCAGTGAGTGAGGCCCGAGTACTAGAGGACAGGCCCCTCAGCGACAAGGG-3’；
GPIIIaPlA1/A野生型：
5’-CAGGAAAGACCACAACAATTTGTTTATGCTCCAATGTACGGGGTAAACTCTTAGCTATTGGGAAGTGGTAGGGCCTGCAGGAGGTAGAGAGTCGCCATAGCTCTGATTGCTGGACTTCTCTTTGGGCTCCTGTCTTACAGGCCCTGCCTCCGGGCTCACCTCGCTGTGACCTGAAGGAGAATCTGCTGAAGGATAACTGTGCCCCAGAATCCATCGAGTTCCCAGTGAGTGAGGCCCGAGTACTAGAGGACAGGCCCCTCAGCGACAAGGG-3’；
PEAR1标准品序列：
PEAR1突变型：
5’-GCTTGAACTTGGGCAGGGGTTGGGGGTGCAGAGGTGAGGGGTTATCCTATGCTACATGACTTCCCAGAGAAGCTGGAAGGGAGCCCGTGGGGAAGTCCCTTCTGCTGTCTCACTTCCGTCACCCTTACTCTCTGCTTTCTATAGAAATGGATCCTCTTGTCCACCAGGAACTCTAATCCCCCCCACCCCTGCTCCCCTAGAGCCCACACTCAATTCCTTCCTCCT-3’；
PEAR1野生型：
5’-GCTTGAACTTGGGCAGGGGTTGGGGGTGCAGAGGTGAGGGGTTATCCTATGCTACATGACTTCCCAGAGAAGCTGGAAGGGAGCCCGTGGGGAAGTCCCTTCTGCTGTCTCACTTCCATCACCCTTACTCTCTGCTTTCTATAGAAATGGATCCTCTTGTCCACCAGGAACTCTAATCCCCCCCACCCCTGCTCCCCTAGAGCCCACACTCAATTCCTTCCTCCT-3’；
PTGS1标准品序列：
PTGS1突变型：
5’-GATTCTATAAATTCGGCGGTGGATGTGAGTCTAGCTACAGCATGGACCCTGGCCAGCCCTGGAATCTGAGTTCAGAGATCTTTGAAAAAATGCCTTCCGATAACTGAGCACCTACTACATGCTGGGCACTGCACCAGGAGATTTGTGTGCATTCCCTCATTGAATCTTACAACCACCCTCTGGGATGGTTTTTGCTATTAAGCCGATTTTATAGATGAGAATACTGAGGGCTAGAAAAGATAAGTACCTTGTCCAAGGTGACACG-3’；
PTGS1野生型：
5’-GATTCTATAAATTCGGCGGTGGATGTGAGTCTAGCTACAGCATGGACCCTGGCCAGCCCTGGAATCTGAGTTCAGAGATCTTTGAAAAAATGCCTTCCGATAACTGAGCACCTACTACATGCTGGACACTGCACCAGGAGATTTGTGTGCATTCCCTCATTGAATCTTACAACCACCCTCTGGGATGGTTTTTGCTATTAAGCCGATTTTATAGATGAGAATACTGAGGGCTAGAAAAGATAAGTACCTTGTCCAAGGTGACACG-3’
GP1BA标准品序列：
GP1BA突变型：
5’-TGGACGTCTCCTTCAACCGGCTGACCTCGCTGCCTCTTGGTGCCCTGCGTGGTCTTGGCGAACTCCAAGAGCTCTACCTGAAAGGCAATGAGCTGAAGACCCTGCCCCCAGGGCTCCTGA...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜睿，
申请(专利权)人：杜睿，
类型：发明
国别省市：湖北;42