一种促进内皮细胞增值的基因复合胶束及其制备方法技术

本发明专利技术通过ATRP方法制备以多面体低聚倍半硅氧烷为骨架的PP星型阳离子聚合物，通过巯基‑双键点击化学反应，将特异性靶向EA.hy926内皮细胞的CREDVW多肽接枝在PP阳离子聚合物末端，得到PP‑CREDVW阳离子聚合物。在n(N)/n(P)＝5时，PP‑CREDVW阳离子聚合物携载pDNA质粒自组装形成粒径为125.67±3.31nm电位为10.64±1.65mV的PP‑CREDVW/pDNA基因复合胶束。结果表明，相比于PP/pDNA基因复合胶束，PP‑CREDVW/pDNA基因复合胶束载基因能力强、细胞毒性低、易被细胞摄取，从而显著提高EA.hy926内皮细胞转染促进细胞增殖。

A kind of gene compound micelle and its preparation method to promote the proliferation of endothelial cells

【技术实现步骤摘要】
一种促进内皮细胞增值的基因复合胶束及其制备方法
本专利技术属于生物材料
，具体涉及一种促进内皮细胞增值的基因复合胶束及其制备方法。
技术介绍
随着分子生物学的发展，阳离子聚合物作为非病毒载体的研究热点备受关注。聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(PDMAEMA)是一种典型的、具有良好生物相容性的阳离子聚合物，PDMAEMA与DNA形成的复合胶束具有卓越的内涵体逃逸能力以及细胞胞内分解能力，因此体外转染效率较高。Stolnik课题组尝试在PDMAEMA链段上接入不同结构的PEG，有效提高了PDMAEMA/DNA复合胶束的稳定性并降低了细胞毒性，但转染效率却很低。李子臣等将酸敏感键引入PDMAEMA/DNA共聚物制备PEG-acid-PDMAEMA嵌段共聚物，PEG-acid-PDMAEMA/DNA在正常生理pH条件和血清环境下很稳定，转染效率与PDMAEMA均聚物相当，但是，由于PDMAEMA/DNA复合胶束在血清条件下稳定性差，故而限制了其作为体内转染试剂的应用。研究发现在相同的分子量下，星型聚阳离子比线形聚阳离子表现出更高的转染效率与更低的毒性，结构也易于设计。制备星型聚合物基因转运载体，通常用生物相容性较理想的核心骨架来支撑，常用的有环糊精、聚苯硫醚等。多面体低聚倍半氧硅烷(Polyhedraloligomericsemisiloxane，POSS)由于结构紧凑、高度对称，能有效降低与内环境中组织的非特异性相互作用，体内外环境中POSS都具有很低的毒性。POSS纳米微粒与其它纳米结构相比，POSS纳米微粒在体内更加稳定，并且其溶液的黏度低，易于在血液中运输，生物相容性好。但是星型阳离子聚合物电荷密度较高，导致了较高的细胞毒性，限制了其在生物体内的应用。以血管内皮细胞(ECs)为模型，研究发现调节ZNF580在EA.hy926内皮细胞中的表达，不仅可以调节MMP-2和VEGF的表达，还可以促进EA.hy926细胞迁移和增殖。经过研究发现，聚(D,L-乙交酯-co-丙交酯)-g-聚乙烯酰亚胺(PLGA-g-PEI)多臂阳离子共聚物，携载融合质粒pEGFP-ZNF580(pDNA)自组装形成基因复合胶束，可将ZNF580基因携带进入EA.hy926细胞，明显增强细胞的迁移能力。但是多臂阳离子共聚物携载融合质粒后，聚合物在细胞上黏附困难，而且多臂阳离子共聚物电荷密度高，导致细胞毒性比较强，严重影响多臂阳离子共聚物的应用。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术提供一种促进内皮细胞增值的基因复合胶束及其制备方法，以解决现有聚合物胶束毒性高以及不易被细胞摄取的问题。为了达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：提供一种促进内皮细胞增值的基因复合胶束的制备方法，包括以下步骤：S1：合成星型阳离子聚合物POSS-(PDMAEMA)4～8；S2：制备POSS-(PDMAEMA)4～8-PPEGMA星型梳状聚合物(PP)，并在星型梳状聚合物(PP)末端引入双键，得双键化的星型梳状聚合物POSS-(PDMAEMA)4～8-PPEGMA-DAs(PP-DAs)；S3：将PP-DAs与三乙胺、2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮和CREDVW多肽混合，N2氛围下紫外光照射10～15min，然后透析、干燥得PP-CREDVWW固体产物；所述PP-DAs与CREDVW多肽的摩尔比为1:10～20；S4：将PP-CREDVWW固体产物分散于PBS溶液中，得PP-CREDVW聚合物胶束；S5：按n(N)/n(P)＝0.5～20的比例向PP-CREDVW聚合物胶束中加入pDNA质粒，经过30min卵育得PP-CREDVW/pDNA基因复合胶束。在上述技术方案的基础上，本专利技术还可以做如下改进。进一步，星型阳离子聚合物POSS-(PDMAEMA)4～8的合成包括以下步骤：(1)制备引发剂POSS-(Br)n：将八氨基POSS、2-溴异丁酰溴和NaOH按1:8～24:10～55的摩尔比混合，于0～5℃下搅拌反应10～18h，得引发剂POSS-(Br)n，其中4≤n≤8；(2)合成POSS-(PDMAEMA)4～8：将引发剂POSS-(Br)n、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、1,1,4,7,10,10-六甲基三亚乙基四胺(HMTETA)和CuBr按1:200～400:8～16:4～8的摩尔比混合，在氮气保护下于50～70℃下反应16～28h；然后将反应产物过中性氧化铝柱，再旋转蒸发得到浓缩液；将浓缩液在正己烷中沉淀2～3次，再在20～37℃下真空干燥至恒重，得POSS-(PDMAEMA)4～8。进一步，POSS-(PDMAEMA)4～8-PPEGMA星型梳状聚合物(PP)的制备包括以下步骤：将POSS-(PDMAEMA)4～8、聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯、HMTETA和CuBr按1:56～80:8～16:4～8的摩尔比混合，在氮气保护下于50～70℃下反应16～28h；然后将反应产物过中性氧化铝柱，再旋转蒸发得到浓缩液；将浓缩液在正己烷中沉淀2～3次，再在20～37℃下真空干燥至恒重，得PP星型梳状聚合物。进一步，双键化的星型梳状聚合物POSS-(PDMAEMA)4～8-PPEGMA-DAs(PP-DAs)的制备方法包括以下步骤：将PP溶解于二甲基亚砜中，配制成浓度为3～5mg/mL的溶液；然后将三乙胺和体积浓度为7％～10％的丙烯酰氯二甲基亚砜溶液加PP物溶液中，于0～5℃下反应10～18h，过滤、提纯、冻干，得双键化的星型梳状聚合物PP-DAs。进一步，S5中按n(N)/n(P)＝5的比例向PP-CREDVW聚合物胶束中加入pDNA质粒。采用上述方法可以制备一种促进内皮细胞增值的基因复合胶束，该胶束载基因能力强、细胞毒性低、易被细胞摄取，从而显著提高EA.hy926内皮细胞转染促进细胞增殖。本专利技术的有益效果是：1.本专利技术的基于POSS的星型具有靶向功能性基因载体，相比较于线型的基因载体，星型结构可以使得正电荷更加集中，从而增强聚合物负载基因的能力；同时以无机POSS为核心的星型结构更容易形成稳定的、粒径更小的胶束，从而更利于细胞的摄取。2.基于POSS的星型具有靶向功能性基因载体以PDMAEMA链段作为负载压缩基因的主要链段，同时还可以增强内涵体逃逸能力。另外，基于POSS的星型多重靶向功能性基因载体通过ATRP反应接枝了具有梳状结构的PPEGMA，屏蔽过多的正电荷，降低了聚合物毒性，同时大大增强了聚合物的亲水性，增强了聚合物在体内循环的稳定性，从而可以有效的进行基因递送。3.PP-CREDVW聚合物胶束能够阻滞pDNA质粒迁移形成稳定的PP-CREDVW/pDNA基因复合胶束，在PP聚合物结构中引入REDV多肽结构，有效降低了细胞毒性，并增强了基因复合胶束与EA.hy926细胞的双向选择，从而提升了基因转运能力提高了细胞转染效率。多肽功能化修饰后PP-CREDVW/pDNA基因复合胶束能够在较低的n(N)/n(P)比携载基因且本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种促进内皮细胞增值的基因复合胶束的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1：取星型梳状聚合物PP，并在星型梳状聚合物末端引入双键，得双键化的星型梳状聚合物PP-DAs；/nS2：将PP-DAs与三乙胺、2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮和CREDVW多肽混合，N

【技术特征摘要】
1.一种促进内皮细胞增值的基因复合胶束的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：取星型梳状聚合物PP，并在星型梳状聚合物末端引入双键，得双键化的星型梳状聚合物PP-DAs；
S2：将PP-DAs与三乙胺、2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮和CREDVW多肽混合，N2氛围下紫外光照射10～15min，然后透析、干燥得PP-CREDVWW固体产物；所述PP-DAs与CREDVW多肽的摩尔比为1:10～20；
S3：将PP-CREDVW固体产物分散于PBS溶液中，得PP-CREDVW聚合物胶束；
S4：按n(N)/n(P)＝0.5～20的比例向PP-CREDVW聚合物胶束中加入pDNA质粒，经过30min卵育得PP-CREDVW/pDNA基因复合胶束。


2.根据权利要求1所述的促进内皮细胞增值的基因复合胶束的制备方法，其特征在于，所述星型梳状聚合物PP的合成包括以下步骤：
(1)制备引发剂POSS-(Br)n：将八氨基POSS、2-溴异丁酰溴和NaOH按1:8～24:10～55的摩尔比混合，于0～5℃下搅拌反应10～18h，得引发剂POSS-(Br)n，其中4≤n≤8；
(2)合成POSS-(PDMAEMA)4～8：将引发剂POSS-(Br)n、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、1,1,4,7,10,10-六甲基三亚乙基四胺和CuBr按1:200～400:8～16:4～8的摩尔比混合，在氮气保护下于50～70℃下反应16～28h；然后将反应产物过...

【专利技术属性】
技术研发人员：朵兴红，冯亚凯，白凌闯，
申请(专利权)人：青海民族大学，
类型：发明
国别省市：青海;63