一株禽源H9N2亚型禽流感毒株分离鉴定及应用制造技术

本发明专利技术涉及动物病毒学领域，本发明专利技术提供一株禽源H9N2亚型禽流感毒株分离鉴定及应用。该H9N2亚型禽流感毒株已于2019年07月02日保藏至中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.18172。本发明专利技术从分子水平阐述分离毒株的抗原变异情况；甲醛灭活后，与605佐剂制备灭活疫苗，免疫21日龄SPF鸡，通过血清学方法和免疫攻毒方法对免疫效果进行评价，证实该毒株保护效果较好，可用作禽流感H9N2亚型疫苗候选毒株。本发明专利技术为禽流感防控提供思路，为禽流感候选毒株筛选提供技术教导，具有重要的公共卫生意义。

Isolation, identification and application of a H9N2 subtype avian influenza strain

【技术实现步骤摘要】
一株禽源H9N2亚型禽流感毒株分离鉴定及应用
本专利技术涉及动物病毒学领域，本专利技术提供一株禽源H9N2亚型禽流感病毒毒株的生物特性研究及在疫苗开发上的应用。技术背景禽流感病毒(Avianinfluenzavirus，AIV)隶属于正粘病毒科A型流感病毒属，核酸为单股负链RNA，总长度约为13.6kb，共含有8个节段，可编码11个蛋白。由于单股负链RNA中HA节段和NA节段最易发生变异这一特性，不同病毒侵入同一宿主时，极易发生不同病毒之间的基因重排，增加病毒变异几率，甚至可能产生新型的流感病毒，改变病毒的宿主侵袭范围及病毒的毒力。按照AIV对家禽致病程度，可分为高致病性(HighPathogenicAvianInfluenzavirus，HPAIV)和低致病性(LowPathogenicAvianInfluenzavirus，LPAIV)，感染家禽的HPAIV和LPAIV分别以H5、H7和H9亚型为主。目前全世界范围的禽群中广泛存在AIV，H9N2亚型发病率占禽流感总发病率90％以上，虽然仅有不到30％的致死率，却可导致呼吸道症状、蛋鸡的产蛋下降，并使鸡群易继发严重的呼吸道疾病，影响家禽生产性能。该病毒自1966年在北美的火鸡体内首次分离，1992年传入我国。该病毒的流行不仅对各国养殖业造成严重损失，还对人类健康构成巨大威胁，积极开展禽流感流行病学调查，对H9N2的分子进化进行长期、持续性的跟踪与监控，并选用保护效果较好的疫苗候选株制备免疫保护效果较好的疫苗，已成为防治H9N2爆发和流行的关键，具有重要的公共卫生学意义。
技术实现思路
本专利技术提供一株H9N2亚型禽流感病毒疫苗候选毒株，阐明HA与NA两个基因片段序列及其与国内经典的疫苗病毒株的系统进化差异；提供该毒株的分离、鉴定和纯化方法；提供利用该毒株制备预防禽流感H9N2灭活苗方法及疫苗判定指标；明确该毒株作为疫苗候选毒株的可行性。专利技术人使用分离、鉴定并纯化好的H9N2亚型禽流感病毒，对以下生物学特性进行确定：1.遗传进化分析：参考Genbank公布H9N2亚型序列，设计HA、NA片段全长引物，并对流感毒株HA、NA片段进行扩增、测序并构建进化图谱。结果表明，HA、NA基因属于H9，4.2(Y280/G9-Like)谱系。2.生长特性：病毒在SPF鸡胚中可稳定高滴度生长，血凝价稳定在10Log2左右。3.HA抗原相关性分析：使用605佐剂，分别制备8株AIV分离毒株灭活疫苗，免疫21日龄SPF鸡用于制备单因子血清，检测HA抗原相关性均大于0.81，可作为H9N2亚型禽流感流感疫苗候选毒株。4.疫苗免疫后保护效果评估：本专利技术使用AIV-BZ株制备灭活苗免疫21日龄SPF鸡用血清学方法与免疫攻毒方法评估保护效果，结果表明，本专利技术使用毒株制备灭活油苗具有很好保护效果。5.本专利技术对禽流感毒株A/chicken/Shandong/BZ/2018(H9N2)(AIV-BZ株)进行生物保藏，保藏信息如下：保藏时间：2019年07月02日保藏单位名称：中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号保藏编号：CGMCCNo.18172分类株命名：禽流感A型流感病毒H9N2亚型本专利技术提供一种H9N2亚型禽流感病毒AIV-BZ株，保藏编号为CGMCCNo.18172。在一个方面中，其在鸡胚中可高滴度增殖，血凝价稳定在210。本专利技术提供一种禽流感灭活疫苗，其包含灭活后的所述H9N2亚型禽流感病毒AIV-BZ株，灭活后病毒液血凝价HA不低于9Log2。本专利技术提供一种所述禽流感灭活疫苗的制备方法，采用所述H9N2亚型禽流感病毒AIV-BZ株接种SPF鸡胚，培养96-120小时，经0.1-0.3％甲醛灭活后与605佐剂按照4:6比例混合制备而成。本专利技术提供一种禽流感病毒HA蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。本专利技术提供一种禽流感病毒HA基因，其编码所述禽流感病毒HA蛋白。本专利技术提供一种扩增禽流感病毒HA基因的引物对，上游引物为AGCAAAAGCAGGAGTAAAAAT，下游引物为AGTAGAAACAAGGAGTTTTTTC。本专利技术提供一种禽流感病毒NA蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。本专利技术提供一种禽流感病毒NA蛋白，其编码所述禽流感病毒NA蛋白。本专利技术提供一种扩增禽流感病毒HA基因的引物对，上游引物为AGCAAAAGCAGGGGAATT，下游引物为AGTAGAAAACAAGGGTGTTTTT。本申请的有益效果：本专利技术分离得到一株H9N2亚型禽流感病毒株A/chicken/Shandong/BZ/2018(H9N2)(ShanDong/BZ)。该病毒AIV-BZ株与其余7株H9N2分离株HA抗原相关性均大于0.81，表明该病毒株与其余流行毒株HA抗原相关性较好，可作为H9N2亚型禽流感疫苗的候选毒株。使用该病毒AIV-BZ株对免疫后的实验组、商品苗与空白对照组进行攻毒实验，发现AIV-BZ株制备灭活苗免疫后14天即可产生免疫保护性抗体，有效保护临床毒株攻击，且保护效果优于当前商品苗(SS株)。由此可见，本专利技术为禽流感防控提供保护效果较好的疫苗候选株，具有重要的公共卫生意义。附图说明图1：H9N2HA基因氨基酸进化树，分离株A/chicken/Shandong/BZ/2018属于H9.4.2(Y280/G9-Like)谱系图2：H9N2NA基因氨基酸进化树，分离株A/chicken/Shandong/BZ/2018属于H9.4.2(Y280/G9-Like)谱系具体实施方式实施例1病毒分离鉴定取发病鸡咽喉腔及泄殖腔拭子于含有青、链霉素双抗(600IU/ml)的PBS缓冲液中处理2小时，充分捻转、挤压，保留液体部分8000rpm离心10min，取上清液0.22um过滤处理，接种9-11日龄SPF鸡胚0.2ml/枚，收集24h后死胚尿囊液，用RT-PCR及血凝试验鉴定其纯净性。对混合感染样品尿囊液1:1加入特异性阳性血清中和，结合鸡胚终点稀释法继续传代。直至尿囊液连续两代检测H9N2血凝价不低于5Log2，AIV其它亚型及NDV血凝价不高于3Log2；同时RT-PCR检测H9为阳性，其余检测均为阴性，鉴定引物如表1。表1鉴别及测序引物结果显示：连续传代3-5代后，RT-PCR检测，仅H9亚型为阳性，H5、H7、NDV及IBV均为阴性；H9血凝价均不低于5Log2，AIV其它亚型及NDV血凝价不高于3Log2。纯化好H9尿囊液连续传代10-12代，HA血凝价稳定维持在10Log2左右，-80℃冻存备用。实施例2病毒HA、NA基因扩增及序列测定1.引物合成根据Genbank公布的序列，用Primer5软件设计HA、NA特异性全长引物，如表2。表本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种H9N2亚型禽流感病毒AIV-BZ株，保藏编号为CGMCC No.18172。/n

【技术特征摘要】
1.一种H9N2亚型禽流感病毒AIV-BZ株，保藏编号为CGMCCNo.18172。


2.如权利要求1所述的H9N2亚型禽流感病毒AIV-BZ株，其在鸡胚中可高滴度增殖，血凝价稳定在210。


3.一种禽流感灭活疫苗，其包含灭活后的如权利要求1所述的H9N2亚型禽流感病毒AIV-BZ株，灭活后病毒液血凝价HA不低于9Log2。


4.一种如权利要求3所述的禽流感灭活疫苗的制备方法，采用如权利要求1或2所述的H9N2亚型禽流感病毒AIV-BZ株接种SPF鸡胚，培养96-120小时，经0.1％-0.3％甲醛灭活后与605佐剂按照4:6比例混合制备而成。


5.一种禽流感病毒HA蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺亚奇，尚川川，武沛泽，王顺山，吴国彬，王延博，赵卓，胡义彬，商云鹏，李晓亮，金扩世，王力，王秀敏，江厚生，
申请(专利权)人：北京华夏兴洋生物科技有限公司，北京生泰尔科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11