重组菌株及其应用制造技术

本发明专利技术提出了一种重组菌株。该重组菌株aroK、aroL与磷酸烯醇式丙酮酸‑糖磷酸转移酶系统操纵子(ptsHIcrr)基因下调以及aroB、aroD、aroE、aroF、tktA、ppsA基因上调。其中，ptsHIcrr包括ptsH基因，ptsI基因以及crr基因。根据本发明专利技术实施例的重组菌株是一种高产莽草酸的工业重组菌株。

Recombinant strain and its application

【技术实现步骤摘要】
重组菌株及其应用
本专利技术涉及生物工程领域，具体地，本专利技术涉及重组菌株及其应用，更具体地，本专利技术涉及重组菌株、构建重组菌株的方法以及获得莽草酸的方法。
技术介绍
莽草酸(3，4，5-3羟基-1-环己烯-1-羧酸)，英文名称：shikimicacid(SA)，是合成的抗病毒药物奥司他韦(可威)的关键中间体。莽草酸为白色针状结晶，易溶于水，难溶于石油醚等一些有机溶剂，气味辛酸，熔点为185-187℃。莽草酸是生物体内芳香族氨基酸生物合成途径中的关键中间体，也是合成吲哚衍生物、生物碱、手性药物(如抗病毒药)的重要前体，具有广泛的药用价值。莽草酸作为中间体化合物的应用可参见图1。在2005年世界禽流感大规模爆发时，以及H7N9型禽流感爆发期间，达菲对这些高致病性流感病毒均表现出了良好的治疗效果，被作为特效药身价倍增，莽草酸作为合成磷酸奥司他韦的前体，也因此备受关注。莽草酸广泛存在于多种植物中，在木兰科植物八角茴香中含量较高，可达成熟干重的10％。野生八角中莽草酸含量较高，是很好的植物提取来源，所以现多采用可食用的八角进行工业提取。植物提取生产工艺复杂，得率较低，原料易受季节气候等因素限制，产量及价格波动较大，难以满足大规模生产需求。莽草酸及其类似物也可通过化学方法合成，奎宁酸转化法则以奎宁酸衍生物和2,2-二甲基丙烷作为原初物质进行合成，其总收率最高可达62％。化学法虽然收率和纯度较高，但受原料来源限制，生产成本过高和化学废物难处理等因素的制约，并未得到广泛应用，因此，利用微生物来生产莽草酸具有极广阔的应用前景。莽草酸途径是存在于植物、真菌和微生物中的一条重要的代谢途径。因此通过基因技术改造代谢途径获得理想的莽草酸工程菌株目前成为研究的新热点。从葡萄糖到莽草酸，主要经过糖酵解途径和戊糖磷酸途径，合成莽草酸有五个重要的酶，分别是-3-脱氧-a-阿拉伯庚糖酸-7-磷酸合成酶(DAHP合成酶)、3-脱氢奎尼酸合成酶，3-脱水奎尼酸合成酶和5-脱氢莽草酸脱氢酶，分别由aroF，aroB，aroD，aroE编码，影响莽草酸的合成，而影响积累的关键酶是莽草酸激酶同工酶和5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶，简称EPSP合成酶，由aroK，aroL，aroA基因进行编码，莽草酸合成途径参考图2。国内外关于莽草酸的菌种构建报道较多，涉及大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌等多个菌种，基因改造策略的重点都是围绕增加前体物供应、减少莽草酸转化消耗、加快胞外的糖运输和转化等方面开展，具体涉及ptsGHI、aroF、aroG、aroB、aroE、tktA、ppsA、glf、glk等基因的敲除和过表达操作，但所构建的重组菌种均产量不足40g/L，难以实现大规模生产应用。2003年密歇根大学及罗氏研发人员在Biotechnol.prog.杂志上发表了改造大肠杆菌生物合成莽草酸的文章。文章中所用的宿主菌为大肠杆菌RB791(EscherichiacoliRB791，ATCC保藏中心编号53622)。其工作主要是对消耗PEP的PTS糖运输途径进行了缺失突变，增加莽草酸合成前体物PEP的供应。改造菌株利用葡萄糖丰富的培养基(配合使用酵母抽提物)进行流加分批发酵，40小时周期可以最高实现84g/L的莽草酸积累。该方法虽然可以得到较高产量，但发酵培养基成本昂贵，限制了其大规模应用的可行性。Rodriguez等2013年通过对大肠杆菌JM101宿主的PTS糖运输途径、aroKL编码的莽草酸激酶进行缺失，在质粒中过表达aroB、tktA、aroGFBR、aroE、aroD、zwf等相关基因，在1L的发酵罐中获得了42g/L的莽草酸。2014年，陈等也对大肠杆菌宿主进行了改造，缺失了arokL编码的莽草酸消耗途径、ptsG编码的糖运输途径、ackA-pta编码的副产物-乙酸积累途径，同时增加aroGFBR、ppsA、tktA基因的表达，在7L的分批补料发酵罐培养实验中获得了14.6g/L的莽草酸积累。国内上海有机所的杨晟等也构建了过表达一系列相关基因aroF、aroE、aroB、ppsA、tktA的质粒pSUFEBPT，在W3110中表达，低糖补料发酵工艺发酵128h后莽草酸产量为39.3g/L。浙江大学陶海明在50L发酵罐上对发酵配方和工艺进行了优化，最终莽草酸单位提高到42g/L。诸多学者在大肠杆菌中构建莽草酸的表达途径，部分菌株的表达需要IPTG和变温诱导，增加了大规模生产的成本与难度，且都未能够突破50g/L的瓶颈，也并未进行100L以上规模的发酵实验，仅停留在实验室阶段，离工业化应用尚有较大差距。
技术实现思路
而本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。本申请的专利技术人针对现有的微生物法合成莽草酸的生产过程中需添加抗生素和诱导剂，并且产量不够理想、副产物过多不利于工业生产的问题，提供了一种改进的重组莽草酸生产菌株及其制备方法。该改进的重组莽草酸生产菌株发酵后所得的莽草酸产量高，生产莽草酸时无需抗生素及诱导剂的添加，降低了生产成本，简化了生产工艺。在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种重组菌株。根据本专利技术的实施例，所述重组菌株aroK、aroL与磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统操纵子(ptsHIcrr)基因下调以及aroB、aroD、aroE、aroF、tktA、ppsA基因上调。其中，ptsHIcrr包括ptsH基因，ptsI基因以及crr基因。根据本专利技术实施例的重组菌株在适宜发酵的条件下培养，50L罐的发酵体系莽草酸产量可达到90.0g/L，500L罐的发酵体系莽草酸产量可达到84.6g/L，8000L罐的发酵规模莽草酸产量可达到73.4g/L。因此，根据本专利技术实施例的重组菌株是一种高产莽草酸的工业重组菌株。根据本专利技术的实施例，上述重组菌株还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本专利技术的实施例，所述aroK、aroL与ptsHIcrr基因沉默。专利技术人发现，采用基因沉默的方式使得aroK、aroL与ptsHIcrr基因下调，其对下游代谢的阻断效果更佳，莽草酸产量提高更加显著。需要说明的是，本申请所述的“aroK、aroL与ptsHIcrr基因沉默”既可以指aroK、aroL或ptsHIcrr基因功能区的沉默，也可指aroK、aroL或ptsHIcrr基因启动子的沉默，只要是aroK、aroL或ptsHIcrr基因不表达或表达量极低，均在本申请“aroK、aroL与ptsHIcrr基因沉默”的限定范围内。根据本专利技术的实施例，所述aroB、aroD、aroE、aroF、tktA、ppsA基因过表达。根据本专利技术的实施例，所述重组菌株为大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌。在本专利技术的第二方面，本专利技术提出了一种构建前面所述的重组菌株的方法。根据本专利技术的实施例，使待改造菌株的aroK、aroL与ptsHIcrr基因下调以及aroB、aroD、aroE、aroF、tktA、ppsA基因上调。根据本专利技术实本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组菌株，其特征在于，aroK、aroL与ptsHIcrr基因下调以及aroB、aroD、aroE、aroF、tktA、ppsA基因上调。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组菌株，其特征在于，aroK、aroL与ptsHIcrr基因下调以及aroB、aroD、aroE、aroF、tktA、ppsA基因上调。


2.根据权利要求1所述的重组菌株，其特征在于，所述aroK、aroL与ptsHIcrr基因沉默。


3.根据权利要求1所述的重组菌株，其特征在于，所述aroB、aroD、aroE、aroF、tktA、ppsA基因过表达。


4.根据权利要求1所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌。


5.一种构建权利要求1～4任一项所述的重组菌株的方法，其特征在于，使待改造菌株的aroK、aroL与ptsHIcrr基因下调以及aroB、aroD、aroE、aroF、tktA、ppsA基因上调。


6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，使待改造菌株的aroK、aroL与ptsHIcrr基因的至少之一的下调是通过基因沉默的方式实现的，
任选地，所述基因沉默是通过shRNA、反义核酸、核酶、显性负突变、CRISPR和锌指核酸酶至少之一实现的，
优选地，所述基因沉默是通过CRISPR实现的。


7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述aroB、aroD、aroE、aroF、tktA、ppsA基因上调是通过如下的方式实现的：
将表达载体导入待改造菌株细胞，所述表达载体携带aroB、aroD、aroE、aroF、tktA、ppsA基因的至少之一；
在适宜基因表达的条件下，对所述待改造菌株细胞进行培养。


8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述表达载体为低拷贝表...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘翠翠，姚红涛，徐宇骋，毛兴艳，温素萍，王鑫鑫，谢文平，李峰，
申请(专利权)人：东莞市东阳光生物合成药有限公司，宜昌东阳光药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44